褪黑素對氧化應激損傷小鼠睪丸支持細胞的作用及機制

劉波，邵帥，江梅，姜經航，曹玉平，王開秀，蔡麗麗，王婷婷，杜家成，王洋，丁濤，洪樂鵬

(1.荊門市第二人民醫(yī)院a.泌尿外科，b.生殖醫(yī)學科，湖北 荊門 448000； 2.廣州醫(yī)科大學人體解剖教研室，廣州 511436)

全世界育齡夫婦中不孕不育的發(fā)生率為15%，而在發(fā)展中國家發(fā)生率可高達30%，其中男性因素約占50%[1]。男性不育因素包括染色體異常、生殖系統(tǒng)感染、精索靜脈曲張等[2-3]。近年來研究顯示，氧化應激損傷精子是導致男性不育的重要原因，氧化應激主要由活性氧引起，過量的活性氧可直接氧化損傷精子質膜蛋白質和脂質、通過線粒體內在凋亡途徑破壞精子DNA的完整性，損傷生精細胞并影響精子最終形成，造成精子形態(tài)改變、功能及代謝異常，從而導致男性不育[4-5]。因此，抗氧化應激減少精子中的活性氧在男性不育中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素是目前已知的強效自由基清除劑，褪黑素不僅可在雄性動物生殖過程提高精子頂體完整性、質膜完整率和線粒體活性，抑制精子凋亡[6]，還可在心肌細胞損傷模型中通過調節(jié)胞外信號調節(jié)激酶信號通路來減弱氧化應激，發(fā)揮心肌細胞保護作用[7]；此外，在熱應激損傷睪丸模型中，褪黑素可以通過抑制自噬和炎癥反應發(fā)揮保護作用[8]。本研究主要探討褪黑素對小鼠睪丸支持細胞氧化損傷的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 TM4細胞由廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院惠贈。DMEM/F12培養(yǎng)基(批號：C11330500BT)、胎牛血清(批號：10091148)、青-鏈霉素(批號：15140122)、0.25%胰蛋白酶(25200056)均購自美國GIBCO公司；褪黑素(批號：M5250)、過氧化氫溶液(批號：323381)均購自美國Sigma公司；甲氮甲唑藍檢測試劑盒購自美國Abcam公司；丙二醛(批號：A003-1-2)、過氧化氫酶(批號：A007-1-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號：A001-3-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)(批號：A005-1-2)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；睪酮和促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)(批號：ab139307)、p-PI3K(批號：ab278545)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)(批號：ab18785)、p-Akt(批號：ab38449)抗體均購自美國Abcam公司；β-actin(批號：TA-09)、山羊抗兔IgG H&L(批號：ZF-0516)購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1TM4細胞培養(yǎng) TM4細胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%雙抗)，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每天更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞貼壁生長到皿底70%～80%進行消化傳代。

1.2.2TM4細胞分組及處理 將培養(yǎng)的細胞消化傳代時，按1×105/ml密度接種于每孔含有2 ml培養(yǎng)液的6孔板中。將孔板按照隨機數(shù)字表法分為對照組、過氧化氫組、過氧化氫+褪黑素組、褪黑素組。過氧化氫組：添加200 μmol/L的過氧化氫孵育8 h；過氧化氫+褪黑素組：過氧化氫處理前半小時添加1 μmol/L的褪黑素預處理；褪黑素組：添加1 μmol/L的褪黑素孵育；對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.3甲氮甲唑藍檢測細胞存活率 將TM4細胞以1×104接種于含有100 μl培養(yǎng)液的96孔板中，按照標題1.2.2中方法處理細胞，空白組(檢測時作為調零孔)添加新鮮培養(yǎng)液，每組6個復孔?？装暹吘売昧姿猁}緩沖液填充，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后去除培養(yǎng)液，并加入180 μl的新鮮培養(yǎng)液，再加入20 μl甲氮甲唑藍溶液(5 μg/ml)，培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜150 μl振蕩至藍紫色結晶溶解，最后酶標儀檢測OD值。每組實驗重復3次。

1.2.4丙二醛、SOD、CAT、GSH-Px活性檢測 TM4細胞按標題1.2.2方法培養(yǎng)和處理細胞后，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，胰蛋白酶消化收集各組細胞，每孔加150 μl RIPA裂解液充分裂解細胞，冰浴裂解30 min，若裂解不充分可通過超聲波震碎，裂解完全后以離心半徑10 cm，12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集EP管中上清液。按照試劑盒說明書進行操作，檢測丙二醛、SOD、CAT、GSH-Px活性。每組實驗重復3次。

1.2.5上清睪酮和FSH水平檢測 TM4細胞按標題1.2.2方法培養(yǎng)和處理細胞后，取細胞培養(yǎng)上清，以離心半徑10 cm、1 000 r/m離心 20 min，按照睪酮和FSH酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書進行操作，檢測上清中睪酮和FSH水平變化。每組實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 TM4細胞按標題1.2.2方法培養(yǎng)和處理細胞后，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，胰蛋白酶消化收集各組細胞，每孔加150 μl RIPA裂解液充分裂解細胞，若裂解不充分可通過超聲波震碎，裂解完全后BCA法檢測蛋白濃度，與5×Loading Buffer混合后煮沸10 min，加樣，各組取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后275 mA電流2 h將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯膜膜，加β-actin、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；第2天山羊抗兔IgG H&L抗體室溫孵育2 h，化學發(fā)光顯影。每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1褪黑素對過氧化氫誘導的TM4細胞增殖的影響 甲氮甲唑藍檢測結果顯示，對照組、過氧化氫組、過氧化氫+褪黑素組、褪黑素組細胞存活率分別為(1.00±0.17)%、(0.73±0.05)%、(0.92±0.04)%、(1.14±0.08)%，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9.557，P=0.005)，與對照組相比，過氧化氫組細胞存活率降低(P<0.01)；與過氧化氫組相比，過氧化氫+褪黑素組細胞存活率升高(P<0.05)；褪黑素組與過氧化氫+褪黑素組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2褪黑素對過氧化氫誘導的TM4細胞內抗氧化指標的影響 活力檢測結果顯示，各組TM4細胞丙二醛、SOD、CAT、GSH-Px表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，與對照組相比，過氧化氫組丙二醛表達升高，SOD、CAT、GSH-Px表達降低(P<0.01)；與過氧化氫組相比，過氧化氫+褪黑素組丙二醛降低(P<0.05)，SOD、CAT、GSH-Px表達升高(P<0.05或P<0.01)；與過氧化氫+褪黑素組相比，褪黑素組丙二醛表達降低(P<0.05)，SOD、CAT表達升高(P<0.05),GSH-Px差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組TM4細胞內抗氧化指標的比較

2.3褪黑素對過氧化氫誘導的TM4細胞性激素的影響 酶聯(lián)免疫吸附法檢測結果顯示：各組睪酮和FSH表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組相比，過氧化氫組睪酮和FSH表達降低(P<0.01)；與過氧化氫組相比，過氧化氫+褪黑素組睪酮和FSH表達升高(P<0.01)；褪黑素組與過氧化氫+褪黑素組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組TM4細胞性激素指標的比較

2.4褪黑素對過氧化氫誘導的TM4細胞PI3K/Akt信號通路的影響 Western blot結果顯示，各組PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與對照組相比，過氧化氫組PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯下降(P<0.01)；與過氧化氫組相比，過氧化氫+褪黑素組PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯升高(P<0.01)；褪黑素組與過氧化氫+褪黑素組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組Akt蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖1。

表3 各組TM4細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達比較

注：PI3K為磷脂酰肌醇-3-激酶，p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶，Akt為蛋白激酶B，p-Akt為磷酸化蛋白激酶B

3 討 論

氧化應激是機體遭遇外界環(huán)境變化刺激時，體內氧化和抗氧化動態(tài)系統(tǒng)失衡，產生過多機體活性氧，導致體內氧化水平超過抗氧化防御而發(fā)生的損害。機體抗氧化清除能力不足時，過量的活性氧能夠引起線粒體損傷，通過凋亡相關信號通路釋放凋亡相關因子，從而引起細胞死亡[9-10]。氧化應激損傷一直被認為是導致男性不育的重要因素之一，過量的活性氧能夠氧化損傷精子的脂質，影響精子體內結構(如線粒體、DNA)，導致精子活力下降，影響精子獲能，甚至誘導精子細胞凋亡，導致男性不育[11]。褪黑素作為一種新型高效抗氧化劑和自由基清除劑，能保護細胞核DNA、膜脂質、胞質蛋白等生物大分子免受氧化損傷。褪黑素在男性生育力保存中有重要作用。近年來，褪黑素對未成熟睪丸組織新鮮度和活性的維持以及對精子和精原性干細胞的保護作用引起人們的廣泛關注[12]。

本研究結果顯示，過氧化氫誘導氧化應激損傷模型能夠導致細胞凋亡，降低細胞存活率；而添加褪黑素能夠促進細胞存活發(fā)揮保護作用，這與Luo等[13]研究褪黑素能夠抑制心肌細胞凋亡，從而起到保護心臟作用的結果一致，說明褪黑素能夠發(fā)揮細胞保護作用，免遭外界損傷刺激。丙二醛是體內脂質過氧化降解的主要終產物，其表達水平反映了細胞受自由基攻擊的程度；SOD作為抗氧化酶主要清除體內過多的自由基保護生物膜系統(tǒng)等；CAT主要破壞氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用；GSH-Px能夠保持谷胱甘肽的活性，維持細胞膜完整的結構和功能。這3種酶作為體內的抗氧化酶，均能清除體內的氧自由基和過氧化物產物，發(fā)揮抗氧化作用，從而降低活性氧對機體造成的損傷[14-15]。在本研究中氧化應激損傷模型中脂質過氧化物丙二醛明顯升高，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活力明顯下降，說明抗氧化能力降低，氧化與抗氧化之間平衡失調，從而影響精子脂膜、破壞膜結構的完整性、損傷線粒體和DNA，導致精子凋亡，從而影響頂體反應和精卵結合[11]；而加入褪黑素能夠降低丙二醛，促進抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活力表達，從而清除氧化產物，抑制羥基自由基的形成，褪黑素還具有抗脂質過氧化作用，并且能夠穩(wěn)定細胞膜，從而抵御自由基攻擊。褪黑素還可以中和高活性羥基自由基，與自由基相互作用后，褪黑素通過轉化為具有自由基清除特性的代謝產物，從而引發(fā)清除級聯(lián)反應[16]。這與孫平等[17]研究褪黑素抑制氧化應激緩解妊娠糖尿病大鼠病理損傷的結果相一致。說明褪黑素能夠清除氧化產物，抑制氧化應激反應，發(fā)揮抗氧化保護作用。

體內性激素主要受下丘腦-垂體-睪丸性腺軸調節(jié)支配，促性腺激素釋放激素通過直接或間接作用釋放激素以及睪酮、FSH、黃體生成素正負反饋作用影響雄性生殖系統(tǒng)，根據(jù)體內睪酮、FSH、黃體生成素的變化來判斷對生殖系統(tǒng)的相關影響[18]。FSH和黃體生成素可以通過下丘腦-垂體-睪丸軸調控精子生成。FSH作用于支持細胞可以促進精子生成，黃體生成素作用于間質細胞產生睪酮，睪酮對于精子的形成至關重要，而且睪酮也可以作用支持細胞，維持和調節(jié)睪丸部分免疫功能，為生精細胞提供足夠的雄性激素，同時為精子發(fā)生提供營養(yǎng)和能量。本研究結果顯示，氧化應激損傷模型中睪酮和FSH表達明顯下降，說明精子形成的調控系統(tǒng)受損，精子形成和成熟受到影響，而加入褪黑素能夠促進睪酮和FSH表達，維持精子形成相關調控。褪黑素可能通過下丘腦-垂體-性腺軸調節(jié)性激素分泌，從而顯著提高睪酮和FSH水平；睪丸內鐘基因Bmal1可通過誘導睪丸合成酶的表達促進睪丸合成睪酮，提示褪黑素可能通過鐘基因Bmal1影響睪酮生成[19]。

PI3K/Akt通路在細胞代謝、生長、增殖、存活、轉錄、凋亡等生理過程中起重要調節(jié)作用，研究顯示PI3K/Akt信號通路參與睪丸支持細胞的增殖[20]，而且腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活劑血管緊張素(1-7)通過PI3K/Akt信號通路來提高少弱精子癥患者的精子活力以及參與頂體反應[21]。褪黑素也可通過PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，增強脊髓損傷后大鼠自噬，減少細胞凋亡，促進運動功能恢復[22]。本研究結果顯示，氧化應激損傷模型中PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達下降，說明氧化應激能抑制PI3K/Akt信號通路表達，這與Yao等[23]研究顯示的氧化應激中PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路受抑制的結論相一致；而加入褪黑素能夠激活PI3K/Akt信號通路，說明褪黑素發(fā)揮抗氧化保護作用與PI3K/Akt信號通路有關。

綜上所述，褪黑素在氧化應激損傷模型中發(fā)揮抗氧化保護作用，促進睪酮和FSH表達，減輕細胞損傷，促進細胞的存活，其調控的可能機制與PI3K/Akt信號通路調節(jié)有關，但具體機制需要深入研究，以為男性不育的臨床治療和基礎研究提供理論基礎。