ICU血流感染患者碳青霉烯類抗菌藥物耐藥肺炎克雷伯菌的毒力和耐藥基因分布及其與感染嚴重程度的相關性

祁晶晶，楊雨陽，馬秀敏，宮海燕，單驕宇

(1.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊 830011)

隨著廣譜抗菌藥物應用的普及，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)耐藥形勢十分嚴峻，特別是對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達32.8%[1]，死亡率明顯高于非耐藥菌株[2]。近年來，KPN的新變種——高毒力KPN(hyper virulent KPN，hvKP)以高致病性、高檢出率和高傳播性為特點，引起人們的關注。與普通KPN不同，hvKP原發(fā)病灶形成后，可在短時間內引起血流播散性感染，且極易導致院內暴發(fā)流行[3]。研究表明，KPN毒力強弱主要與其攜帶的毒力基因有關，這些基因對KPN的黏附性和侵襲性等產生影響，從而使患者感染KPN后，在感染嚴重程度和預后方面存在差異[4]。但目前關于hvKP的研究多集中于毒力基因的分子流行病學特點，其與患者感染嚴重程度和預后的相關性尚未見報道。本研究擬探討耐碳青霉烯類KPN(carbapenem-resistant KPN，CR-KP)血流感染患者中高毒力CR-KP(carbapenem-resistant hyper virulent KPN，CR-hvKP)毒力基因的流行病學特點，并分析毒力基因與感染嚴重程度的相關性，以期為患者臨床治療和預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年1月至2020年12月新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院檢驗科首次分離的180株非重復CR-KP，以上菌株來自180例重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)血流感染患者的血液樣本(多次標本送檢者以第一次檢查結果為準)。納入標準：①患者血流感染臨床診斷明確，所有經血液分離的CR-KP菌株經VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統鑒定；②患者年齡≥18周歲，男女不限。排除標準：①合并其他細菌引起的感染；②無法獲得膿毒癥相關序貫器官衰竭(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)評分。本研究經新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意(倫理批準號：XYDWFYLSH-2019-012)。

1.2菌株鑒定和藥敏試驗 采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國梅里埃公司)對分離的CR-KP進行鑒定并進行藥敏試驗，參照由美國臨床和實驗室標準化協會制訂的2017年版標準進行判讀[5]。其中，CR-KP菌株定義為KPN對美羅培南或亞胺培南任一種碳青霉烯類抗菌藥物最低抑菌濃度≥4 mg/L。對所有分離的CR-KP菌株進一步行拉絲試驗，即使用接種環(huán)在培養(yǎng)皿上挑起經24 h培養(yǎng)的CR-KP菌落，重復牽拉2次，若每次長度均≥5 mm，則鑒定為CR-hvKP。

1.3碳青霉烯酶耐藥基因、血清莢膜分型及毒力基因檢測

1.3.1DNA模板制備 用接種環(huán)從培養(yǎng)皿中挑取適量菌落至1.5 ml EP管，加入滅菌去離子水300 μl后震蕩混勻，并以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心5 min，用移液槍棄去上清液。向離心所得的沉淀物中再次加入300 μl滅菌去離子水，震蕩混勻，于100 ℃煮沸15 min后，以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，抽取上清液即為DNA模板。

1.3.2引物設計 參考Antony等[6]的研究設計肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)、新德里金屬-β-內酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)、苯唑西林酶-48型(oxacillinaase-48，OXA-48)和金屬β-內酰胺酶(verona integron-mediated，VIM)4種碳青霉烯酶耐藥基因引物序列。參考El-Mahdy等[7]和Xu等[8]研究分別設計K1、K2、K5、K20、K54和K57 6種莢膜血清分型引物和rmpA、iutA、rmpA2、magA、allS、wcaG、aerobactin、ybtS、entB、kfu9 10種常見毒力基因引物。各引物相關信息見表1。

1.3.3聚合酶鏈反應體系及反應條件 聚合酶鏈反應體系25 μl，其中包括DNA模板、引物正向引物和引物反向引物各1 μl，Taq PCR Master Mix 12.5 μl，雙蒸水9.5 μl。聚合酶鏈反應條件：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性60 s，退火30 s(根據產物大小略有不同)，72 ℃ 延伸60 s，32個循環(huán)，72 ℃ 延伸7 min。

1.3.4電泳 取5 μl聚合酶鏈擴增產物并將其加入2.0%瓊脂糖凝膠上樣孔，分別將電壓和電流設定為180 V和200 mA，電泳30 min后于紫外燈檢測儀下觀察結果，并進行攝像保存結果。

表1 各基因聚合酶鏈反應引物序列及擴增長度

2 結 果

納入本研究的180株CR-KP宿主中男116例、女64例，年齡51～78歲，平均(64±11)歲；合并糖尿病43例，合并高血壓46例；治療過程中接受氣管插管患者105例，患者均聯合使用2種或2種以上抗菌藥物，以碳青霉烯類和β-內酰胺酶抑制劑復方制劑為主。其中CR-hvKP感染患者62例(34.4%)。

2.1CR-KP血流感染患者的臨床特征分析 CR-hvKP組患者年齡、合并糖尿病及30 d內死亡比例明顯高于CR-non-hvKP組(P<0.05)，兩組性別、合并高血壓、醫(yī)源性侵襲操作、抗菌藥物暴露情況比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CR-hvKP組與CR-non-hvKP組血流感染患者臨床特征比較

2.2CR-KP菌株耐藥基因檢測 180株CR-KP菌株中檢出攜帶KPC基因172株，攜帶NDM基因8株，未檢出OXA-48和VIM基因。其中攜帶KPC基因的菌株在CR-hvKP組和CR-non-hvKP組分別有61株(98.4%)和110株(93.2%)，攜帶NDM基因的菌株在CR-hvKP組和CR-non-hvKP分別有1株(1.6%)和7株(5.9%)，兩組比較差異無統計學意義(χ2=2.284，P=0.131；χ2=1.785，P=0.181)。

2.3CR-KP血清莢膜分型和毒力基因 本研究中僅檢出3株K2血清夾膜分型，均來自CR-hvKP菌株，其余CR-KP未獲得血清夾膜分型。ICU血流感染患者CR-KP菌株攜帶的毒力基因以ybtS(95.6%)和entB(81.7%)為主，其中CR-hvKP組菌株中攜帶rmpA、iutA和rmpA2毒力基因的比例高于CR-non-hvKP組(P<0.05)，CR-hvKP與CR-non-hvKP組其余毒力基因分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 180株毒力基因檢出情況及在CR-hvKP組和CR-non-hvKP組的分布

2.4毒力基因與SOFA評分的相關性 180株CR-KP宿主SOFA評分3～15分，平均(8.1±3.0)分。Spearman相關分析結果顯示，毒力基因rmpA、iutA和rmpA2與SOFA評分呈正相關(P<0.001)，與其他毒力基因無相關性(P>0.05)。見表4。

3 討 論

隨著我國碳青霉烯類抗菌藥物應用的不斷增加，CR-KP的檢出率呈逐年增長趨勢，由CR-KP導致的感染已成為目前抗感染治療的棘手問題。近年來，不斷有碳青霉烯類抗菌藥物耐藥hvKP流行的臨床報道[3，9]，該類菌株不僅表現出對多種碳青霉烯類

表4 180株CR-KP宿主毒力基因與SOFA評分的相關性

抗菌藥物耐藥的特點，同時相較于非高毒力CR-KP，侵襲能力更強、播散范圍更廣、致死率更高，對患者生命健康造成了極大威脅，成為目前臨床抗感染治療領域關注的焦點。然而，目前關于CR-hvKP感染患者毒力基因分布特征及其與感染嚴重程度關系的報道非常有限。

大量研究證實，高齡、合并多種基礎疾病、碳青霉烯類抗菌藥物暴露史及醫(yī)療侵襲性操作是CR-KP感染的獨立危險因素[10-11]。本研究以ICU患者作為研究對象，該類患者往往合并多種基礎疾病，治療過程中侵襲性操作較多，且抗菌藥物的暴露明顯高于非ICU，是醫(yī)療機構中CR-KP流行的重點區(qū)域。結果顯示，CR-hvKP組的年齡、合并糖尿病及患者30 d內死亡比例明顯高于CR-non-hvKP組(P<0.05)。提示高齡和糖尿病是hvKPN感染的重要誘發(fā)因素，該類患者往往病程進展較快，死亡率更高。

本研究中所檢出的ICU血流感染患者致病菌CR-KP均為多重耐藥細菌。產碳青霉烯酶是碳青霉烯類抗菌藥物對KPN耐藥的最常見耐藥機制[12]。其中，KPC型是目前較為關注的碳青霉烯酶。本研究180株CR-KP中，攜帶KPC基因的菌株達到95.0%(171/180)，提示產KPC型碳青霉烯酶可能是ICU血流感染患者CR-KP耐藥的主要機制。然而，本研究中也發(fā)現8株攜帶NDM基因的CR-KP。研究發(fā)現，產NDM的CR-KP呈上升趨勢，且在治療藥物的選擇上與產KPC的CR-KP也存在明顯不同[13-14]，因此應引起臨床醫(yī)師的重視。

現有研究證實，CR-KP的致病能力主要通過莢膜多糖、高黏液型及鐵攝取等毒力因子實現[15]。其中，莢膜是一種覆蓋于細菌細胞壁表面的多糖物質，具有顯著的抗宿主殺傷作用，可規(guī)避免疫細胞的吞噬作用，目前被認為是CR-KP最重要的毒力因子之一。常見的高毒力KPN莢膜分型包括K1、K2、K5、K20、K54和K57[16]，而本研究中僅在CR-hvKP菌株中發(fā)現3株攜帶K2抗原的菌株，其他菌株均未獲得常見的抗原分型，其原因可能是CR-KP在獲得耐藥基因的同時莢膜的表達出現下降或出現了其他莢膜分型的表達，導致常見莢膜分型無法檢測。本研究結果還顯示，毒力基因rmpA、rmpA2和iutA與SOFA評分呈正相關(P<0.01)，提示攜帶這些基因的CR-KP感染患者的病情更嚴重，預后更差。rmpA和rmpA2是黏液表型的重要調節(jié)因子，可促進細菌表面保護性生物膜的形成，且兩者均可參與自身代謝，具有高度的同源性[17]，而氣桿菌素iutA則是鐵攝取系統相關基因，可與rmpA和rmpA2共同作用、相互影響，增加細菌的繁殖能力和黏附性，加速細菌的播散，從而加重感染情況[18]。杜芳玲等[19]研究發(fā)現，ICU血流感染患者中，CR-KP菌株攜帶rmpA、rmpA2和iutA基因的患者死亡率更高，提示其感染可能更加嚴重。而郝超國等[20]分析哮喘合并KPN肺部感染患者疾病嚴重程度與毒力基因的相關性發(fā)現，攜帶rmpA和rmpA2基因的KPN肺部感染患者病情更嚴重。本研究結果與以上研究結果基本一致。

綜上所述，ICU中CR-KP血流感染患者菌株主要以產KPC為主，且攜帶多種毒力基因，其中rmpA、rmpA2和iutA基因與疾病的嚴重程度顯著相關，攜帶上述基因的CR-hvKP感染患者的死亡率較高。臨床中應注重ICU細菌流行病學的調查研究，增強醫(yī)護人員對CR-KP的認識，以減少醫(yī)院獲得性感染的發(fā)生。