基于Notch信號(hào)通路探討電針“人中”穴對(duì)腦梗死模型大鼠腦血管新生的分子機(jī)制

張敏，李晶

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381)

腦梗死的病理過(guò)程極為復(fù)雜，但其起始是由腦缺血觸發(fā)。因腦血流量占心排血量的13%，且不能豐富和存儲(chǔ)能量，所以腦組織對(duì)血液循環(huán)較其他任何器官均更加依賴。腦梗死治療的最終目的是恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的功能。神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)和增殖需要血管的營(yíng)養(yǎng)支持，缺血后腦微血管的再生和微循環(huán)的改善可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和存活。以往研究表明，大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠在進(jìn)行電針人中穴后會(huì)促進(jìn)梗死區(qū)周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并可將增殖出現(xiàn)的時(shí)間提前[1]，說(shuō)明電針人中穴可促進(jìn)腦梗死半暗帶的血管新生，從而促進(jìn)腦梗死后側(cè)支循環(huán)的重建。

Notch信號(hào)通路是與細(xì)胞活性、存活和分化相關(guān)的高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2]，Notch信號(hào)通路對(duì)血管生成和血管成熟有重要影響，有關(guān)基因在調(diào)節(jié)胚胎血管生成中發(fā)揮重要作用[3-4]，并與腦梗死后的血管新生關(guān)系密切。本研究通過(guò)電針MCAO模型大鼠“人中”穴，觀察腦梗死后缺血區(qū)腦組織中新生血管形態(tài)及Notch信號(hào)通路相關(guān)因子的變化規(guī)律，探討電針“人中”穴對(duì)腦梗死后血管新生的干預(yù)機(jī)制，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 無(wú)特定病原體級(jí)健康雄性Wistar大鼠126只(由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，5～6周齡，體重180～200 g。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和電針組，后兩組每組60只，并按干預(yù)1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、3 d、7 d、12 d分為10個(gè)時(shí)相(每個(gè)時(shí)相6只)，空白組6只。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 韓氏電針儀(北京華運(yùn)安特科技公司，型號(hào)：LH202H)、熒光顯微鏡[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司，型號(hào)：AF6000]、石蠟切片機(jī)(北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：RM2235)，DAPI溶液(即用型)(北京索萊寶生物工程公司，批號(hào)：C0065)、Ki67(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bsm-33070M，規(guī)格：50 μl)、CD31(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AF6408，規(guī)格：50 μl)、Notch1[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab52301，1∶100，規(guī)格：100 μg]、Notch4[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab184742，1∶200，規(guī)格：100 μl]、Dll4[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab217860，1∶200，規(guī)格：100 μl]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型制備 采用Longa的腔內(nèi)線栓法建立永久性MCAO大鼠模型[5]，待大鼠充分麻醉后，將其固定于手術(shù)臺(tái)上，找到并分離出頸總動(dòng)脈，然后沿頸總動(dòng)脈向上找到頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的分叉處，分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在距分叉處5 mm的頸總動(dòng)脈上用血管剪斜剪一小口，立即插入栓線，緩慢向內(nèi)推進(jìn)線栓，適當(dāng)調(diào)整方向和角度，手下感到阻力后即停止。將固定動(dòng)脈血管和線栓的縫合線系緊，血管復(fù)位，縫合皮膚并局部消毒。模型組與電針組均造模成功，各組大鼠健康狀況良好。

1.3.2電針干預(yù)方法 電針組在建立模型后即刻針刺大鼠人中穴[6]。用針灸針在大鼠人中穴(正極)向上斜刺2 mm，并在該處下約2 mm處刺入一針作為參考電極(負(fù)極)，2/15 Hz、2 mA持續(xù)電刺激20 min。24 h內(nèi)各組(1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h)總共針刺1次，其余各時(shí)相組每日針刺1次。模型組和空白組均同樣抓取固定，但不進(jìn)行任何治療。

1.3.3神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分 電針干預(yù)結(jié)束后，采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological severity scores，NSS)[7]對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分范圍為0～18分，評(píng)分越高代表?yè)p傷程度越嚴(yán)重。

1.3.4免疫熒光雙標(biāo)記 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將灌注后的腦組織進(jìn)行外固定、脫水、包埋及切片，加入自發(fā)熒光淬滅劑，山羊血清封閉后加CD31、Ki67一抗混合的抗體稀釋液，封片。在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并攝取圖像，CD31以腦組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜紅染為免疫熒光陽(yáng)性；Ki67以增殖細(xì)胞核綠染為免疫熒光陽(yáng)性；DAPI以細(xì)胞核藍(lán)染為免疫熒光陽(yáng)性。采用Image Pro Plus6圖像分析系統(tǒng)，每一張切片隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性表達(dá)的高倍視野，計(jì)算其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行半定量分析。

1.3.5免疫組織化學(xué) 采樣與制備切片方法同前，組織切片抗原修復(fù)，滴加山羊血清封閉，滴加按一定比例配好的一抗(Notch1、Notch4和Dll4)，然后滴加二抗，滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺顯色液，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水封片，蘇木精染細(xì)胞核為藍(lán)色，二氨基聯(lián)胺法顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)。將采集的圖片用Image pro plus6軟件分析每個(gè)區(qū)域的平均光密度。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠NSS比較 術(shù)前，各組大鼠NSS均為0分；各時(shí)相模型組、電針組大鼠的NSS均高于空白組(P<0.01)；電針組與模型組大鼠干預(yù)3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h時(shí)的NSS比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組大鼠干預(yù)3 d、7 d、12 d的NSS均低于模型組(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)相NSS比較 (n=6，分，

2.2電針對(duì)MCAO模型大鼠新生血管的影響 模型組24 h時(shí)出現(xiàn)CD3和Ki67的共陽(yáng)性細(xì)胞，3 d時(shí)達(dá)峰值；電針組和模型組的表達(dá)趨勢(shì)相同，但在12 h時(shí)CD3和Ki67的共陽(yáng)性細(xì)胞即開始表達(dá)，3 d時(shí)達(dá)峰值后逐漸下降。見表2及圖1。

表2 各組大鼠不同時(shí)相新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)比較 (n=6)

2.3各組大鼠腦組織Notch相關(guān)因子的表達(dá)

2.3.1Notch1相對(duì)表達(dá)情況 模型組、電針組各時(shí)相的Notch1表達(dá)量均高于空白組(P<0.05或P<0.01)。模型組Notch1的表達(dá)量在1 h開始上升，3 d到達(dá)峰值后下降，12 d時(shí)仍高于正常水平；電針組的Notch1表達(dá)趨勢(shì)與模型組大致相同，且兩組在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h時(shí)的Notch1表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組18 h、24 h、3 d、7 d、12 d時(shí)的Notch1表達(dá)量高于模型組(P<0.05或P<0.01)。見表3及圖2。

2.3.2Notch4相對(duì)表達(dá)情況 模型組、電針組與空白組1 h時(shí)的Notch4表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組與空白組3 h、12 d時(shí)的Notch4表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組12 d時(shí)的Notch4表達(dá)量高于空白組、模型組(P<0.05)，其余各時(shí)相模型組、電針組的Notch4表達(dá)量均高于空白組(P<0.05)。模型組的Notch4表達(dá)量在3～12 h持續(xù)上調(diào)，9 h到達(dá)峰值后下降，3 d到達(dá)第二峰值后再次下降；電針組的Notch4表達(dá)量在3 h逐漸上調(diào)，3 d到達(dá)峰值后下調(diào)，兩組在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h時(shí)的Notch4表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)相電針組的Notch4表達(dá)量均高于同時(shí)相模型組(P<0.05)。見表4及圖3。

注：箭頭所示為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞

表3 各組大鼠不同時(shí)相腦組織Notch1的表達(dá)情況比較

圖2 各組大鼠不同時(shí)相腦組織Notch1的表達(dá)情況(二氨基聯(lián)苯胺法，×200) 2a為空白組干預(yù)24 h,2b為模型組干預(yù)24 h,2c為模型組干預(yù) 3 d,2d為模型組干預(yù)7 d,2e為模型組干預(yù)12 d,2f為電針組干預(yù)24 h,2g為電針組干預(yù)3 d,2h為電針組干預(yù)7 d,2i為電針組干預(yù)12 d

2.3.3Dll4相對(duì)表達(dá)情況 模型組與空白組在1 h、6 h、9 h、12 h、3 d時(shí)的Dll4表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)相模型組的Dll4表達(dá)量均高于空白組(P<0.05)；電針組與空白組9 h時(shí)的Dll4表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，電針組1 h時(shí)的Dll4表達(dá)量低于空白組(P<0.05)，其余各時(shí)相電針組的Dll4表達(dá)量均高于空白組(P<0.05)。模型組的Dll4表達(dá)量3 h開始上調(diào)，24 h到達(dá)最高水平后開始下調(diào)，7 d時(shí)再次上調(diào)，12 d時(shí)下降。電針組的Dll4表達(dá)趨勢(shì)與模型組大致相同，3 h開始上調(diào)，9 h后下降，12 h又開始繼續(xù)上調(diào)，24 h到達(dá)最高水平后開始下調(diào)，7 d 時(shí)再次上調(diào)，12 d時(shí)下降，12 d 時(shí)仍高于正常水平。模型組與電針組在3 h、6 h、9 h、18 h、3 d、7 d時(shí)的Dll4表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電針組1 h時(shí)的Dll4表達(dá)量低于模型組(P<0.05)，其余各時(shí)相電針組的Dll4表達(dá)量高于模型組(P<0.05)。見表5及圖4。

表4 各組大鼠不同時(shí)相腦組織Notch4的表達(dá)情況比較

圖3 各組大鼠不同時(shí)相腦組織Notch4的表達(dá)情況(二氨基聯(lián)苯胺法，×200) 3a為空白組干預(yù)24 h,3b為模型組干預(yù)24 h,3c為模型組干預(yù) 3 d,3d為模型組干預(yù)7 d,3e為模型組干預(yù)12 d,3f為電針組干預(yù)24 h,3g為電針組干預(yù)3 d,3h為電針組干預(yù)7 d,3i為電針組干預(yù)12 d

表5 各組大鼠不同時(shí)相腦組織D114 的表達(dá)情況比較

圖4 各組大鼠不同時(shí)相腦組織D114 的表達(dá)情況(二氨基聯(lián)苯胺法，×200) 4a為空白組干預(yù)24 h,4b為模型組干預(yù)1 h,4c為模型組干預(yù) 12 h,4d為模型組干預(yù)24 h,4e為模型組干預(yù)12 d,4f為電針組干預(yù)1 h,4g為電針組干預(yù)12 h,4h為電針組干預(yù)24 h,4i為電針組干預(yù)12 d

3 討 論

腦梗死發(fā)生后，缺血和缺氧會(huì)導(dǎo)致大量神經(jīng)元的變性和壞死，引發(fā)神經(jīng)功能障礙。腦梗死患者腦內(nèi)血管密度越高，神經(jīng)功能恢復(fù)越好，故腦梗死后需盡快改善血液循環(huán)，增加腦血流量，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立。

NSS可以評(píng)價(jià)腦缺血大鼠神經(jīng)功能。本研究中，模型組和電針組的術(shù)后NSS均隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，且在3 d、7 d、12 d時(shí)，電針組大鼠NSS均低于模型組(P<0.05或P<0.01)，證明電針人中穴可以顯著改善神經(jīng)功能缺損癥狀。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，模型組24 h時(shí)開始出現(xiàn)CD3和Ki67的共陽(yáng)性細(xì)胞；電針組在12 h時(shí)共陽(yáng)性細(xì)胞開始表達(dá)，3 d時(shí)達(dá)峰值，12 d時(shí)仍有少量表達(dá)。Beck等[8]使用CD31和Ki67進(jìn)行了免疫熒光雙標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在梗死周圍區(qū)域可檢測(cè)到增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞，共表達(dá)在MCAO后24 h開始，在MCAO后3 d達(dá)到最大值，此后降低。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。可見，電針人中穴可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖時(shí)間提前，并使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)量增加，增殖時(shí)間延長(zhǎng)，直觀地證明了電針可促進(jìn)梗死后血管新生。

研究表明，Notch信號(hào)通路主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)尖端細(xì)胞和莖細(xì)胞分化，尖端細(xì)胞和莖細(xì)胞的表型是由Dll4和Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[9-10]；同時(shí)，Notch信號(hào)通路還可以調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中Dll1、Dll4、Notch1、Notch4的靶向缺失以及Notch3的敲除可導(dǎo)致動(dòng)脈表達(dá)標(biāo)志物減少，抑制靜脈分化[11-16]。Notch信號(hào)受體中Notch1和Notch4與其配體Dll4等作為動(dòng)脈內(nèi)皮標(biāo)志物，在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路相關(guān)基因，如Dll4、Notch1等，在生理性血管生成中亦能影響動(dòng)、靜脈分化[18]。綜上可知，Notch信號(hào)通路能夠影響血管的發(fā)育和形成，對(duì)血管的發(fā)育和形成具有重要作用。既往研究表明，電針人中穴可通過(guò)促進(jìn)血管新生相關(guān)因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)梗死后神經(jīng)血管網(wǎng)中微血管的生長(zhǎng)、成熟和穩(wěn)定[19-20]。且電針人中穴可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-328 及靶基因CD44促進(jìn)血管新生，改善腦缺血癥狀[21]。

本研究中，MCAO后模型組Notch通路相關(guān)因子Notch1、Notch4及Dll4的表達(dá)隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出上升到達(dá)一個(gè)峰值再下降的趨勢(shì)；電針組的表達(dá)趨勢(shì)和模型組相似，但電針組的Notch1、Notch4以及Dll4表達(dá)量較模型組均呈現(xiàn)一定程度的上調(diào)。提示電針人中穴可提高Notch信號(hào)通路相關(guān)因子的相對(duì)表達(dá)水平，并使表達(dá)時(shí)相前移，說(shuō)明電針人中穴可通過(guò)促進(jìn)Notch信號(hào)通路的激活，從而誘導(dǎo)梗死后血管的生長(zhǎng)、成熟和穩(wěn)定?？梢?，腦梗死后積極早期進(jìn)行電針治療，可激活Notch信號(hào)通路，促進(jìn)血管新生，對(duì)于腦梗死的預(yù)后也可能有很大幫助。但本實(shí)驗(yàn)仍存在一定的局限性，如樣本量較少，存在采樣的差異性，還有待大樣本深入研究；此外，Notch信號(hào)通路與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路之間的相互作用對(duì)腦梗死的保護(hù)機(jī)制也需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Notch信號(hào)通路相關(guān)因子的研究，從電針促進(jìn)血管新生角度深入探討了針刺促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立的分子機(jī)制，觀察發(fā)現(xiàn)電針可以促使血管新生時(shí)間提前，并能促進(jìn)新生血管網(wǎng)的形成。