QuEChERS技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中6種替考拉寧殘留量

金 慧，趙 城，鄭光明，魏琳婷，史曉娜，林嘉薇，李麗春，單 奇，馬麗莎，尹 怡*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（廣州）/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380）

替考拉寧（Teicoplanins）是一種從游離放線菌Actinoplanes teichomyceticus 中分離出的新型糖肽類抗生素［1］。它由替考拉寧A2-1（TA2-1）、替考拉寧A2-2（TA2-2）、替考拉寧A2-3（TA2-3）、替考拉寧A2-4（TA2-4）、替考拉寧A2-5（TA2-5）、替考拉寧A3-1（TA3-1）6 種結(jié)構(gòu)相似但抑菌活性不同的成分組成［2］，對革蘭氏陽性需氧菌和厭氧菌具有良好的抗菌活性［3］。1975年，第一代糖肽類抗生素阿伏霉素在英國、挪威等一些國家作為食品動物的飼料添加劑，用于疾病治療與促生長［4］，但引起了耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生與大范圍傳播［5］。隨后，另一種糖肽類抗生素——萬古霉素被用在食品動物的養(yǎng)殖中并加重了細(xì)菌耐藥性問題［6］，替考拉寧則是繼萬古霉素之后的新型糖肽類抗生素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中違規(guī)使用、甚至濫用糖肽類抗生素，均會對我國水產(chǎn)品出口貿(mào)易及消費者身體健康產(chǎn)生不利影響。為確保食品安全和人類健康，許多國家制定了糖肽類抗生素的限量標(biāo)準(zhǔn)。日本規(guī)定了食品動物中萬古霉素的限量為10 μg/kg［7］，我國2020年發(fā)布的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250公告也將萬古霉素列為水產(chǎn)品等食品動物中的禁用藥［8］，歐盟規(guī)定食品動物中禁止使用阿伏霉素和萬古霉素［9］，而美國規(guī)定進(jìn)口動物源性食品中禁止使用替考拉寧等糖肽類抗生素［10］。Yin 等［11］在我國珠江及沿海流域的水環(huán)境中檢出痕量替考拉寧，表明水產(chǎn)魚類面臨潛在的安全風(fēng)險。因此，需要建立一種準(zhǔn)確高效的檢測方法用于分析魚肉中替考拉寧的殘留水平及其風(fēng)險。

替考拉寧分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組成成分多且相似，實現(xiàn)其在復(fù)雜基質(zhì)中的高效、靈敏檢測存在困難。常見測定替考拉寧的分析方法有熒光偏振免疫分析法（FPIA）［12-13］、高效液相色譜法（HPLC）［14-15］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［16-18］等。其中，F(xiàn)PIA 法測定替考拉寧易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，準(zhǔn)確度低。HPLC法難以進(jìn)行替考拉寧多組分的區(qū)分測定，且分析時間長、靈敏度低。LC-MS/MS法可通過特定的母離子和子離子實現(xiàn)替考拉寧多組分的準(zhǔn)確識別及高靈敏檢測［19-20］。由于水產(chǎn)品中富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)等復(fù)雜成分，且待測物含量低，分析常需要復(fù)雜的前處理方法凈化，操作較繁瑣耗時。QuEChERS 技術(shù)是2003 年Anastassiades 等提出的樣品前處理技術(shù)，包含了樣品的提取和凈化兩個步驟，具有簡單、快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點［21］。該技術(shù)早期在水果、蔬菜等食品基質(zhì)的多農(nóng)藥殘留檢測中展現(xiàn)了良好的分析效果［22］。近年來，QuEChERS 技術(shù)在一些復(fù)雜基質(zhì)如水產(chǎn)品［23］、蜂蜜［24］、乳制品［25］、土壤［26］等領(lǐng)域均得到應(yīng)用，涉及的檢測目標(biāo)物包括氟蟲腈［27］、喹烯酮［28］、雌激素［29］、真菌毒素［30］等。然而在糖肽類抗生素的檢測中，QuEChERS 技術(shù)目前鮮有報道。基于此，本研究建立了QuEChERS 技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS 測定魚肉中6種替考拉寧組分的分析方法，進(jìn)行了方法學(xué)評價并應(yīng)用于實際樣品的檢測。該方法靈敏度高、精密度好、簡單高效，可用于魚肉中替考拉寧殘留的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290 高效液相色譜和6470 三重四極桿質(zhì)譜（美國Agilent 科技公司）；FP3010 料理機（德國Braun 公司）；電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Genie 15 超純水系統(tǒng)（中國Rephile 公司）；TDL-5-A 離心機（上海安亭公司）；IKA MS3 basic 旋渦振蕩儀（德國IKA 公司）；KQ5200E 超聲清洗儀（昆山市超聲儀器公司）；N-EVAP112氮吹儀（美國Organomation公司）。

替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%，含有TA3-1，TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5，上海ZZBIO公司）；硫酸多粘菌素B（純度為91%，Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，東京化成工業(yè)株式會社）；乙酸銨（分析純，阿拉丁公司）；氨水（25%）、三氯乙酸、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（分析純，麥克林公司）；氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，50 μm）、十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm）購自天津Agela 公司；石墨化炭黑（GCB）購自CNW 公司；陶瓷均質(zhì)子15 mL tubes 購自美國Agilent 科技公司；0.22 μm PTFE 微孔濾膜購自天津Agela 公司；實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸多粘菌素B（內(nèi)標(biāo)），用0.1%甲酸水分別溶解定容至10 mL，制得1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃避光保存。用甲醇-0.1%甲酸（1∶1，體積比）分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液制得10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光保存。用甲醇-0.1%甲酸（1∶1）將替考拉寧稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線校準(zhǔn)溶液（均含有內(nèi)標(biāo)30 ng/mL）。

1.3 樣品前處理

提取：準(zhǔn)確稱取1.00 g已絞碎混勻的魚肉樣品于15 mL聚丙烯離心管中，加入30 μL 1 μg/mL 的硫酸多粘菌素B 溶液作為內(nèi)標(biāo)，渦旋10 s 后常溫下放置30 min。加入2.5 mL 乙腈-10%三氯乙酸溶液（6∶4）和陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻1 min，超聲10 min，5 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至15 mL 聚丙烯離心管；殘渣重復(fù)提取1次，合并上清液。

凈化：向上清液中加入100 mg PSA，渦旋30 s，5 000 r/min 離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 玻璃離心管中，40 ℃氮吹至近干，用1 mL 0.1% 甲酸乙腈-水（4∶6）定容，過0.22 μm 微孔濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent SB C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm），柱溫：35 ℃，流速：0.30 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。流動相：A 為0.1%甲酸乙腈，B 為0.1%甲酸。梯度洗脫：0～0.5 min，5%B；0.5～1.0 min，5%～30%B；1.0～2.0 min，30%～40%B；2.0～3.0 min，40%～95%B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～4.0 min，5%B。

離子源：電噴霧離子源，掃描方式：正離子模式，監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式，干燥氣溫度：300 ℃，干燥氣流速：5 L/min，霧化氣壓力：0.24 MPa，鞘氣溫度：325 ℃，鞘氣流速：9 L/min，毛細(xì)管正向電壓：3 500 V，噴嘴正向電壓：500 V。6種替考拉寧組分和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下6種替考拉寧的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of six teicoplanins in the multi-reaction monitoring mode

1.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）通常由與分析物共萃取的基質(zhì)組分引起，可以抑制或增強分析物在ESI條件下的電離響應(yīng)，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。通過在流動相溶劑中配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率進(jìn)行比較，可計算出基質(zhì)效應(yīng)［31］，其計算公式為：ME（%）=(Bs-As)/As×100%，式中Bs表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，As表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1 mg/L替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)工作液以0.01 mL/min流速注入電噴霧離子源中，對6種替考拉寧組分的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在正離子模式下，替考拉寧的6個組分均易帶多個電荷，如［M+H］+、［M+2H］2+和［M+3H］3+。對其靈敏度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)替考拉寧各組分的［M+2H］2+離子具有較好的豐度值。利用選擇的母離子進(jìn)一步碰撞產(chǎn)生子離子，每個分析物通過一個母離子和兩個子離子進(jìn)行監(jiān)測。通過優(yōu)化碎片電壓、碰撞能等參數(shù)確定最佳定性、定量離子。通過優(yōu)化鞘氣溫度、鞘氣流速等離子源參數(shù)確定最佳離子源條件。結(jié)果顯示，替考拉寧中的TA2-2 和TA2-3、TA2-4 和TA2-5 為兩對同分異構(gòu)體，在定性時無法進(jìn)一步分離，只能進(jìn)行總量測定。硫酸多粘菌素B 與替考拉寧具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，均為極性較強的化學(xué)物質(zhì)，在LC-MS/MS中可以較好地分離，不對待測組分的檢測造成干擾。此外，由于水產(chǎn)行業(yè)內(nèi)不使用硫酸多粘菌素B，因此本研究選取硫酸多粘菌素B作為內(nèi)標(biāo)物。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對比了流動相分別為甲醇和乙腈的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈對6種替考拉寧組分的分離效果更好。通過向流動相中加入0.1%甲酸、0.2%甲酸以及0.01 mol/L乙酸銨觀察峰形及靈敏度變化，結(jié)果顯示替考拉寧各組分在0.1%甲酸流動相中具有最佳的響應(yīng)值且峰形尖銳對稱。因此，實驗采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。在此條件下，6 種替考拉寧組分得到良好的分離和較高的靈敏度，分析物的色譜圖如圖1所示。

圖1 6種替考拉寧組分及內(nèi)標(biāo)物（10 ng/mL）的色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of six teicoplanin components and the internal standard substance at 10 ng/mL

2.3 提取條件的優(yōu)化

替考拉寧是一種極性較強的多肽類物質(zhì)［2］，根據(jù)相似相溶原則，實驗對比了甲醇、乙腈和水等溶劑對替考拉寧的提取效果。發(fā)現(xiàn)采用甲醇和乙腈進(jìn)行提取時，提取效率較低；采用水進(jìn)行提取時，提取液中雜質(zhì)較多，目標(biāo)物受基質(zhì)影響導(dǎo)致靈敏度降低。基于乙腈和三氯乙酸沉淀蛋白的優(yōu)勢，本研究考察了不同濃度乙腈-三氯乙酸水溶液的提取與凈化效果。結(jié)果顯示，隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的升高，目標(biāo)物的回收率上升，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為20%～60%時，目標(biāo)物的回收率在75%左右，為達(dá)到好的凈化效果，實驗選擇60%乙腈水溶液進(jìn)行提取（圖2A）。進(jìn)一步調(diào)節(jié)三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn)，在三氯乙酸為0%～10%時，目標(biāo)物的回收率不斷上升至接近90%，三氯乙酸為10%～40%時，目標(biāo)物的回收率趨于穩(wěn)定并有下降趨勢。依據(jù)經(jīng)濟環(huán)保原則，實驗選擇10%的三氯乙酸（圖2B），即選擇乙腈～10%三氯乙酸（6∶4，體積比）作為最佳提取溶劑。進(jìn)一步考察了不同體積（2、4、5、6、8、10 mL）提取溶劑的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mL提取溶劑可實現(xiàn)良好的提取效果（圖2C）。

圖2 不同提取條件對6種替考拉寧組分回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction conditions on recoveries of six teicoplanin components

在QuEChERS 方法中，常采用無機鹽使有機相與水相分層，促進(jìn)目標(biāo)物從水相轉(zhuǎn)移到有機相中。實驗比較了不加入無機鹽，加入2.0 g 無水硫酸鈉及加入2.0 g 無水硫酸鎂時對目標(biāo)物回收率的影響。發(fā)現(xiàn)鹽的加入降低了目標(biāo)物的回收率（圖2D）。因此，實驗選擇不加無水硫酸鈉等鹽。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

在凈化過程中，吸附劑通過吸附作用減少基質(zhì)干擾物的含量，從而提高目標(biāo)物的回收率。實驗采用100 μg/kg的空白基質(zhì)加標(biāo)樣品作為對照，比較了不同吸附劑（PSA、C18和GCB）對目標(biāo)物回收率的影響（圖3A）。發(fā)現(xiàn)使用PSA后，替考拉寧各組分的回收率約為90%；使用C18后，替考拉寧各組分的回收率低于80%；而使用GCB 后，各組分的回收率均低于60%，原因可能是其吸附含有苯環(huán)平面的物質(zhì)［32］。因此，實驗選擇PSA作為最佳凈化劑。

為獲得良好的凈化效果，進(jìn)一步對不同PSA 用量（25、50、75、100、150 mg）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3B 所示。當(dāng)PSA 用量增加時，替考拉寧各組分的回收率不斷上升，在100 mg時，6種替考拉寧均獲得最佳回收率，當(dāng)PSA達(dá)到150 mg時，目標(biāo)物的回收率明顯下降。因此，實驗選擇100 mg PSA 用于樣品凈化。

圖3 吸附劑種類（A）及用量（B）對6種替考拉寧組分回收率的影響Fig.3 Effects of adsorbent type（A）and dosage（B）on recoveries of six teicoplanin components

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

由于魚肉樣品富含脂肪、蛋白質(zhì)等基質(zhì)，在進(jìn)行LC-MS/MS 樣品分析時易引起基質(zhì)效應(yīng)。采用5 種空白基質(zhì)（羅非魚、鯽魚、鯉魚、大黃魚和鱖魚）配制相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，與流動相配制的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，評價了6種替考拉寧組分在不同種類魚中的基質(zhì)效應(yīng)（ME）。當(dāng)ME 為正值時表示信號增強，為負(fù)值時表示信號抑制，|ME|范圍在0～20%、20%～50%和＞50%時分別呈現(xiàn)弱、中、強基質(zhì)效應(yīng)［33］。采用本方法進(jìn)行檢測，不同魚肉基質(zhì)中替考拉寧組分的基質(zhì)效應(yīng)如圖4 所示，5 種魚肉中替考拉寧均表現(xiàn)出基質(zhì)抑制作用，|ME|在1.16%～19.82%之間，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱。

圖4 替考拉寧組分在5種魚類中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of six teicoplanin components in five fishs

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

采用“1.2”配制的質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的替考拉寧系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入內(nèi)標(biāo)物（質(zhì)量濃度為30 ng/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并做線性回歸分析，結(jié)果如表2所示。6種替考拉寧的相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.998，線性范圍為1～100 ng/mL 或2～100 ng/mL。在空白樣品中添加目標(biāo)物，以信噪比為3和10分別計算檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），測得其LOD為0.5～2.0 μg/kg，LOQ為2.0～5.0 μg/kg。

表2 替考拉寧組分的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of six teicoplanins

2.7 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用羅非魚、鯽魚、鯉魚、大黃魚和鱖魚等5 種陰性樣品作為空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。分別在5.0、10.0、25.0 μg/kg 3 個濃度水平添加6 種替考拉寧，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6），結(jié)果見表3、表4。所有分析物的加標(biāo)回收率為84.3%～93.3%，日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別不大于7.0%、6.2%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，能夠滿足多種魚肉的日常檢測需求。

表3 6種替考拉寧在魚肉樣品中的回收率及日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of intra-day of six teicoplanin in spiked fish（n=6）

表4 6種替考拉寧在魚肉樣品中的回收率及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Average recoveries and RSDs of inter-day of six teicoplanins in spiked fish（n=6）

2.8 實際樣品的測定

從市場購得40份魚肉樣品，包括鯽魚、鯉魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鱖魚、羅非魚、大黃魚和大菱鲆等9 個品種。采用建立的方法進(jìn)行實際樣品測定，發(fā)現(xiàn)40 份魚肉樣品中均未檢出替考拉寧成分。選取其中3種空白魚肉樣品，按5.0 μg/kg 濃度水平添加替考拉寧混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行提取和測定，得到加標(biāo)回收率為86.7%～91.2%，符合質(zhì)控要求，表明該方法可用于實際樣品的分析。

3 結(jié) 論

本研究采用QuEChERS 結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時測定魚肉樣品中多種替考拉寧組分的檢測方法。實驗優(yōu)化了質(zhì)譜條件、色譜條件及QuEChERS 前處理步驟，考察了多種魚肉樣品中的基質(zhì)效應(yīng)并進(jìn)行了方法學(xué)評價。所有分析物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量下限為2.0～5.0 μg/kg。目標(biāo)物在多種魚肉樣品中的回收率為84.3%～93.3%，日內(nèi)及日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于7.0%，基質(zhì)效應(yīng)弱。結(jié)果表明該方法簡單、高效、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，可用于實際魚肉樣品6種替考拉寧組分的準(zhǔn)確定量分析。