金釵石斛多糖提取分離、結(jié)構(gòu)解析及生物活性研究進(jìn)展

代國(guó)娜，尚明越，王嘉樂(lè)，鄭加梅，徐福榮，宋經(jīng)元，段寶忠*

1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000

2.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650504

3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193

金釵石斛Dendrobium nobileLindl.是名貴藥材石斛的基原植物之一，藥用部位為新鮮或干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟[1]。現(xiàn)代研究表明金釵石斛含有多糖、生物堿等多種化合物[2]，其中生物大分子多糖也是金釵石斛的主要生物活性分子之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等藥理活性[3-6]。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)金釵石斛的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[7-9]，但尚未見(jiàn)對(duì)其多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)解析和生物活性進(jìn)行系統(tǒng)報(bào)道。鑒于此，本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外金釵石斛多糖提取分離、結(jié)構(gòu)特征和生物活性及其作用機(jī)制的研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，以期為金釵石斛資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 金釵石斛多糖的提取和分離純化

1.1 金釵石斛多糖的提取

金釵石斛多糖的提取方法主要有水提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶提取法等[8]?；谏鲜鎏崛」に?，多位學(xué)者采用單因素與正交試驗(yàn)或響應(yīng)面法結(jié)合的方式，以苯酚硫酸法檢測(cè)多糖得率，對(duì)金釵石斛多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化[10-13]。研究顯示，微波輔助提取法提取率高、提取時(shí)間短、耗能小、成本低，更合適廣泛推廣和普及，該法與傳統(tǒng)水提醇沉法相比可顯著提高金釵石斛多糖的提取率，影響金釵石斛多糖得率的因素依次為料液比、提取時(shí)間、微波時(shí)間[11]；水提取法操作簡(jiǎn)單，成本低，應(yīng)用廣泛，一般考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)等因素，多采用料液比1∶10～1∶52，溫度在59～100 ℃，提取時(shí)間1～2.5 h，反復(fù)提取后，得粗多糖[14-18]。有機(jī)溶劑提取法中多以乙醚為提取劑，60～100 ℃加熱回流2～3 h進(jìn)行提取[13,19]。超聲波輔助提取法利用超聲振動(dòng)的空化、機(jī)械粉碎以及熱學(xué)等作用，破壞藥材細(xì)胞，加快藥材有效成分的溶出，進(jìn)而達(dá)到高效提取的目的[20]。余芳等[10]通過(guò)正交試驗(yàn)考察超聲輔助提取法各因素對(duì)金釵石斛多糖得率的影響，明確影響大小依次為料液比、超聲時(shí)間、溫度，并建立了最佳工藝。酶提取法利用酶水解或降解植物細(xì)胞壁，增強(qiáng)細(xì)胞通透性，從而提高有效成分的提取率[21]。張曉敏等[22]對(duì)金釵石斛多糖纖維素酶提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該法的多糖得率比熱回流提取法高43.84%。金釵石斛多糖提取方法的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 金釵石斛多糖提取方法Table 1 Extraction methods of polysaccharides from D.nobile

1.2 金釵石斛多糖的分離純化

金釵石斛粗多糖樣品中一般含有低聚糖、蛋白質(zhì)、色素和脂質(zhì)等雜質(zhì)，需分離去除雜質(zhì)后，再進(jìn)行純化方可獲得均一多糖[28]。金釵石斛粗多糖中的小分子物質(zhì)通常采用多次醇沉去除[29]；蛋白多采用Savage法和凍融法去除[26,30-31]，脫色方法常采用活性炭吸附法、雙氧水氧化法、吸附樹(shù)脂法[30,32]。金釵石斛多糖的分離純化主要采用柱色譜法、分步沉淀法和超濾法等[33]；其中以柱色譜法應(yīng)用最為廣泛，通常采用二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纖維柱聯(lián)合葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離，首先采用DEAE-52纖維柱按極性大小進(jìn)行分離，再根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小，用Sephacryl S和Sephadex G系列柱進(jìn)行純化[34]。除此之外，還有少數(shù)采用AB-8大孔樹(shù)脂吸附法或乙醇梯度醇沉法[17,26]；金釵石斛多糖的相關(guān)純化方法見(jiàn)表2。

表2 金釵石斛多糖的分離純化過(guò)程及結(jié)果Table 2 Separation and purification of polysaccharides from D.nobile

2 金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)研究

2.1 金釵石斛多糖相對(duì)分子質(zhì)量

相對(duì)分子質(zhì)量是多糖重要物理特征之一，可間接反映其純度[40]。多位學(xué)者均采用高效凝膠滲透色譜法對(duì)金釵石斛中多糖的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行了測(cè)定，分離得到均一多糖的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布范圍為817～770 000[17,34-35,39]，見(jiàn)表3。

2.2 金釵石斛多糖的單糖組成

單糖組成通常先通過(guò)酸水解的方法將多糖水解成單糖，以標(biāo)準(zhǔn)單糖為對(duì)照，水解產(chǎn)物采用柱前衍生高效液相色譜法[46]、陰離子交換色譜安培法[47]、糖醇乙酸酯衍生化后聯(lián)合氣相色譜法[31,36]和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化-高效液相色譜（PMP-HPLC）法[36,41]等進(jìn)行定性、定量分析。研究結(jié)果顯示，金釵石斛多糖的單糖組成豐富，但主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成，此外還含有鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等，見(jiàn)表3。

2.3 金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)特征

金釵石斛多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究甚少，仍處于起步階段，目前，有關(guān)其化學(xué)結(jié)構(gòu)解析主要通過(guò)甲基化、高碘酸鹽氧化、Smith降解及1D/2D核磁共振譜（NMR、COSY、HSQC、HMBC和TOCSY）分析[26,34-36]。金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)信息見(jiàn)表3。

3 金釵石斛多糖的生物活性

3.1 抗炎

炎癥與多種疾病密切相關(guān)[48]。研究顯示，金釵石斛多糖可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放，顯著抑制炎癥反應(yīng)[49-50]，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，其還可顯著降低大鼠腦缺血-再灌注區(qū)炎癥反應(yīng)[51-52]。此外，金釵石斛多糖可對(duì)抗LPS引起的大鼠海馬神經(jīng)元炎癥反應(yīng)，降低TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）蛋白及其mRNA表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[53]；另有研究表明，金釵石斛多糖可保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥因子的損傷，其機(jī)制為抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的產(chǎn)生[54-55]。

續(xù)表3

3.2 免疫調(diào)節(jié)

機(jī)體免疫功能的維持依賴(lài)體內(nèi)各種免疫器官及細(xì)胞。金釵石斛精制多糖和粗制多糖均能直接促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，并對(duì)刀豆蛋白、LPS分別誘導(dǎo)的脾T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用[19]；多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖DNP-W1B、DNP-W、DNP-W2、DNP-W3、HDNP-W2等均對(duì)脾T細(xì)胞和B細(xì)胞具增殖作用，且呈劑量相關(guān)性[31,44,56]。此外，金釵石斛多糖DNP-W5的分支和乙酰基，具有增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫活性作用[45]；Fan等[57]研究了含金釵石斛多糖的血清對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW264.7的影響，結(jié)果表明含藥血清可顯著提高其吞噬能力，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1的分泌，并在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)IL-1β的表達(dá)。

3.3 抗氧化和抗衰老

金釵石斛多糖對(duì)不同的氧化體系均具有抗氧化能力，具有顯著的量效關(guān)系，并對(duì)2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸+［2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)+，ABTS+］、二苯基苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羥基自由基（·OH）、亞硝酸根（NO2?）有較強(qiáng)的清除能力[58-60]，與其他石斛多糖相比，金釵石斛多糖清除·OH、NO2?能力最佳，但無(wú)明顯差異[59]；通過(guò)對(duì)金釵石斛等5種石斛植物多糖的ABTS+、·OH清除能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各酸性多糖抗氧化活性與糖醛酸含量呈正相關(guān)，與硫酸糖含量呈負(fù)相關(guān)[60]；研究顯示，金釵石斛多糖可抵抗高糖誘導(dǎo)下的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，其機(jī)制為促進(jìn)細(xì)胞核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）蛋白表達(dá)和核移位，上調(diào)醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）mRNA的表達(dá)[61]。此外，謝苗苗等[18]采用H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖有顯著的抗細(xì)胞衰老作用；亦有研究表明，金釵石斛多糖具有抗衰老作用，可拮抗D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠免疫器官及組織的萎縮和病變[62]；還可延緩秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)平均生存時(shí)間，其機(jī)制與提高線(xiàn)蟲(chóng)抗應(yīng)激能力有關(guān)[5,63]。

3.4 抗腫瘤

抗腫瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究是多糖藥效研究的熱點(diǎn)，從金釵石斛中分離得到的DNP-W1、DNP-W3多糖，對(duì)肉瘤S-180細(xì)胞和人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞具有顯著的抑制活性[64]；金釵石斛水提物對(duì)人宮頸癌HelaS3細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞有不同程度的抑制作用，其可能機(jī)制是抑制原癌基因c-myc的表達(dá)[65]；金釵石斛多糖可抑制BALB/c荷瘤鼠皮膚腺癌移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]；此外，多糖DNP4-2能顯著提高免疫指數(shù)，并促進(jìn)IL-2、TNF-α和γ干擾素（interferon-γ，IFNγ）的分泌，降低血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度，提示DNP4-2是一個(gè)潛在的抗腫瘤藥物[30]；金釵石斛多糖能明顯降低腎母細(xì)胞瘤WT1蛋白表達(dá)水平，對(duì)白血病細(xì)胞有一定殺傷作用[66]，亦可直接抑制慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其可能機(jī)制與金釵石斛多糖抑制K562細(xì)胞中BCR-ABL融合基因的表達(dá)有關(guān)[67]。

3.5 抗肝損傷

金釵石斛多糖的抗肝損傷作用主要包括抗酒精性、非酒精性和肝纖維化肝損傷。研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖對(duì)亞急性酒精性肝損傷有一定程度的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制肝組織氧化和炎性損傷[68]；金釵石斛多糖對(duì)肝纖維化大鼠的肝損傷具有明顯的效果，其機(jī)制與亞急性酒精性肝損傷相同[69]；進(jìn)一步研究顯示，金釵石斛多糖抗肝纖維化的作用機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1）mRNA表達(dá)，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA表達(dá)有關(guān)[70]；此外，金釵石斛多糖可明顯改善高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病大鼠肝功能和血脂，機(jī)制可能與降低炎性小體NOD樣受體蛋白3的蛋白及mRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控IL-1β和IL-18，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[71]；亦有研究顯示，金釵石斛多糖可以明顯改善非酒精性脂肪肝病的預(yù)后，降低大鼠肝臟中細(xì)胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）蛋白及mRNA表達(dá)，進(jìn)而改善肝功能和血脂水平，提高過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活力，最終有效緩解非酒精性脂肪肝病[72]。

3.6 抗糖尿病及其并發(fā)癥

糖尿病是臨床最常見(jiàn)的代謝性疾病，多由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙，以高血糖為特征，其病程緩慢，在發(fā)展過(guò)程中可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，尤其是易引起相關(guān)器官損害，以糖尿病心肌損傷最為常見(jiàn)[73-74]。研究表明，金釵石斛多糖對(duì)腎上腺素引起的高血糖小鼠有明顯的降血糖作用，但對(duì)正常小鼠血糖無(wú)明顯影響，其可能機(jī)制為抑制肝糖元分解和肌糖元酵解，促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用[75]；趙亨等[76-77]研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖能增加高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞的胰島素分泌量；此外，研究表明金釵石斛多糖可降低血糖和升高胰島素含量，可明顯促進(jìn)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-xL分泌，并降低Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和Bad的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞保護(hù)作用[78]；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖可提高大鼠抗氧化能力，增加心臟組織中MMP-1和MMP-9的表達(dá)，改善2型糖尿病心肌損傷大鼠心功能，且具有明顯的劑量相關(guān)性[74,79]；同時(shí)，王軍輝[34]研究證實(shí)，金釵石斛粗多糖及各均一多糖組分都對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病性白內(nèi)障有一定的延緩作用，且各多糖處理組之間差異較大，以粗多糖與DNPW1A的效果最好，呈劑量相關(guān)性。

3.7 其他

金釵石斛多糖還具有其他藥效，如多糖乙酰衍生化物可促進(jìn)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞神經(jīng)軸突出的生長(zhǎng)，硫酸衍生化物可抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的管腔形成、HMEC-1的遷移以及體內(nèi)血管生成[36]；樊小寶等[80]研究表明，金釵石斛多糖可改善多柔比星腎病大鼠的腎功能和腎纖維化。此外，金釵石斛粗多糖通過(guò)拮抗晶狀體氧化損傷，發(fā)揮抗白內(nèi)障的作用[81]；多糖JCP-40對(duì)預(yù)防胃黏膜具有保護(hù)作用[26]。還可增加脂肪的利用，延緩乳酸的積累，起到抗疲勞作用[82]。

金釵石斛多糖的主要生物活性及其作用機(jī)制見(jiàn)圖1。

圖1 金釵石斛多糖的主要生物活性及其作用機(jī)制Fig.1 Main bioactivities and mechanisms of polysaccharides from D.nobile

4 結(jié)語(yǔ)

石斛入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用十分廣泛，被稱(chēng)為“九大仙草”，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，這與現(xiàn)代研究相近；多糖作為金釵石斛中的主要活性物質(zhì)，藥理研究表明具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病、保肝等多方面的藥理活性，無(wú)疑將會(huì)成為開(kāi)發(fā)健康產(chǎn)品的最佳原料選擇之一，存在巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前，對(duì)金釵石斛多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定、活性評(píng)價(jià)方面的研究已取得一定進(jìn)展，但其多糖的結(jié)構(gòu)及質(zhì)量和藥效評(píng)價(jià)尚存在很多問(wèn)題。一方面，金釵石斛多糖的提取純化和結(jié)構(gòu)表征分析，是金釵石斛多糖產(chǎn)業(yè)化的重要前提，但金釵石斛的提取、分離純化方法仍不成熟，質(zhì)量控制指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)尚不完善，以致最終得到的多糖結(jié)構(gòu)及活性均存在一定的差異；其次，金釵石斛多糖結(jié)構(gòu)的研究不少，但是真正得到一級(jí)結(jié)構(gòu)的卻很少，其多糖的結(jié)構(gòu)特征與各種活性之間的構(gòu)效關(guān)系尚只是初步探討，探索金釵石斛多糖的質(zhì)控評(píng)價(jià)方法和高級(jí)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，加深對(duì)其結(jié)構(gòu)及生物活性之間關(guān)系的解析，是未來(lái)研究金釵石斛多糖的重點(diǎn)，仍需要大量的研究工作進(jìn)行補(bǔ)充確定；此外，有關(guān)金釵石斛多糖生物活性的研究，尚處于細(xì)胞、器官和組織的初級(jí)探索階段，許多目標(biāo)靶點(diǎn)的分子機(jī)制仍然需要深入探討。因此，建立高效穩(wěn)定的分離純化方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步深入研究金釵石斛多糖的結(jié)構(gòu)特征、藥理活性及其構(gòu)效關(guān)系，將為金釵石斛資源綜合開(kāi)發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)鏈延伸具有重要價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突