基于垂直密度梯度離心全自動血脂譜檢測法的家族性高三酰甘油血癥家系血脂亞組分分析

何志潔，何津春，2，張燕培，王耀東，王占科

1. 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730013；2. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，蘭州 730013；3. 寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗所，寧波 315105

家 族 性 高 三 酰 甘 油 血 癥 （familial hypertriglyceridemia， FHTG） 是 以 三 酰 甘 油（triacylglycerol，TAG）合成增加為特征的常染色體顯性遺傳病，可導(dǎo)致過量的富含TAG 的極低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL） 顆粒產(chǎn)生，成年人發(fā)病率為5%～10%［1-2］。FHTG患者血清TAG水平通常為2.26～7.91 mmol/L（200～700 mg/dL）［3］，然而，由于TAG 水平受飲食和時間等因素的影響，在正常生理狀態(tài)下處于波動狀態(tài)，所以同一個體在多次測定時，TAG 值可能有較大差異［4］。因此，僅依靠患者血脂水平、個人病史及家族史等臨床資料進行FHTG 的診斷存在一定的誤診率，所以有必要聯(lián)合其他標志物進行輔助診斷。垂直密度梯度離心全自動血脂譜檢測法（vertical auto profile，VAP）基于經(jīng)典的超速離心法，將主要類別的脂蛋白分離為各自的亞組分；該技術(shù)最大限度地保留脂蛋白原始的顆粒狀態(tài)，較為真實地反映出血漿脂蛋白的分布狀態(tài)，是脂蛋白分離的參考方法［5］。本研究應(yīng)用VAP 對一個FHTG 家系的成員進行血脂亞組分的測定，以期找到新的可用于FHTG 診斷和鑒別診斷的指標，從而為FHTG 的早期診斷和篩查提供新手段。

1 對象與方法

1.1 納入標準

根據(jù)FHTG 家系診斷標準［6］：包括先證者在內(nèi)，家系中至少有2 個一級親屬血清TAG≥2.26 mmol/L，總膽固醇（total cholesterol，TC）<5.18 mmol/L；家族其他成員中無其他類型的高脂蛋白血癥。

1.2 研究對象及分組

收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院1 個符合FHTG 家系診斷標準的FHTG 家系。該家系來源于國家“十五”重大科技專項“重大疾病遺傳資源的收集、保存與利用”的子課題“Ⅱ、Ⅳ型遺傳性高脂血癥家系血標本收集及臨床流行病學(xué)研究”（2002BA711B08-17）的積累，均已排除因內(nèi)分泌疾病等繼發(fā)性因素導(dǎo)致TAG升高的家系成員。納入研究的家系成員共3代13人：FHTG患者7人，血脂正常6人；男性7人，女性6人。根據(jù)TAG是否升高（≥2.26 mmol/L），將家系成員分為高TAG組（n=7）和對照組（n=6）。

1.3 臨床資料收集

通過對家系成員身高、體質(zhì)量、腰圍等一系列指標的檢測，填寫“家系調(diào)查表”，同時收集家系成員的年齡、性別、生活習(xí)慣及病史等一般資料，并計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。

1.4 檢測方法

抽取13 位家系成員空腹血5 mL，低速離心2 533×g5 min 后將血清分為2 份。1 份血清標本于2 h內(nèi)在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院使用美國Beckman Coulter AU5800 全自動生化分析儀進行生化項目（血脂、血糖、肝功能、腎功能）檢測。另1 份血清標本經(jīng)2～8 ℃的冷鏈運輸至寧波美康盛德醫(yī)學(xué)檢驗所采用VAP檢測血脂亞組分［5，7］。

1.4.1 生化指標檢測 血脂檢測指標包括TC、TAG、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、載脂蛋白AⅠ（apolipoprotein A Ⅰ，apo A Ⅰ）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，apo B）、脂蛋白a ［lipoprotein（a），Lp （a）］。LDL-C、HDL-C 的檢測使用美國Beckman Coulter 公司配套原裝試劑，TC、TAG、apo AⅠ、apo B、Lp （a）的檢測使用北京九強生物技術(shù)有限公司測定試劑盒。

1.4.2 血脂亞組分檢測 在特制的梯度介質(zhì)內(nèi)將血漿快速垂直離心后，得到脂蛋白分層的樣本。隨后將離心后的樣本放在血脂亞組分檢測儀（MS-V600）上，儀器將離心管的底部戳破，分層的脂蛋白從離心管底部流下來，并依次與膽固醇試劑反應(yīng)，獲得連續(xù)的脂蛋白膽固醇檢測圖譜。通過軟件計算出每種脂蛋白膽固醇的含量，包括TC、TAG、LDL-C、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、VLDL、極低密度脂蛋白3 （very-low-density lipoprotein 3，VLDL3）、HDL-C、高 密 度 脂 蛋 白2 （high-density lipoprotein 2，HDL2）、高密度脂蛋白3（high-density lipoprotein 3， HDL3）、 中 間 密 度 脂 蛋 白（intermediate-density lipoprotein，IDL）、脂蛋白殘粒（remnant-like lipoprotein particle，RLP）、非高密度脂蛋白（non-high-density lipoprotein， non-HDL）?；贚DL 最大時間值分析LDL 密度模式：小而密LDL（B 型）對應(yīng)的時間（≤115 s），大而疏LDL（A 型）對應(yīng)的時間（≥118 s），中間密度（A/B型）介于兩者之間［5］。在生化儀上使用膠乳增強免疫比濁法測定Lp （a）濃度。

利用垂直脂蛋白圖譜法（vertical lipoprotein profile，VLP）檢測低密度脂蛋白顆粒（low-density lipoprotein particle，LDL-P），利用垂直梯度超速離心法分離各類脂蛋白，隨后利用位于VLP 分析儀上的檢測器，通過檢測器的多角度激光散射來測定LDL組分中的LDL-P濃度。

使用MS-V600 型VAP 血脂亞組分檢測儀（江西美康盛德生物科技有限公司）檢測IDL、VLDL3等指標，使用MS-V800 型血脂顆粒檢測儀（江西美康盛德生物科技有限公司）檢測血清LDL-P。血脂亞組分、Lp （a）和LDL-P檢測所需試劑盒及其配套檢測設(shè)備均為該公司產(chǎn)品。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對資料進行統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行2 組間比較；定性資料以n（%）表示，采用Fisher 確切概率法進行2組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家系系譜圖

根據(jù)臨床資料繪制FHTG 家系系譜圖，見圖1。對照組：Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ6。高TAG組：Ⅰ2、Ⅱ4、Ⅱ6、Ⅱ8（先證者）、Ⅲ3、Ⅲ4、Ⅲ5。先證者Ⅱ8，患FHTG 36年；先證者一代親屬Ⅰ2，患FHTG 38 年；先證者二代親屬Ⅱ4，患FHTG 22年；先證者二代親屬Ⅱ6，患FHTG 25 年；先證者三代親屬Ⅲ3，患FHTG 16 年；先證者三代親屬Ⅲ4，患FHTG 3 年；先證者三代親屬Ⅲ5，患FHTG 17年。

圖1 家系系譜圖Fig 1 Pedigree diagram of the family

2.2 一般資料

本研究納入的FHTG 家系成員中，高TAG 組身高、體質(zhì)量、BMI、腰圍明顯高于對照組（P=0.022，P=0.000，P=0.001，P=0.000），且2 組間性別差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.029），2 組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.561），見表1。

表1 FHTG家系成員基本特征Tab 1 Basic characteristics of FHTG family members

2.3 家系成員臨床特征

家系成員聽、觸、叩診均無異常。實驗室檢查：臨床常規(guī)血脂檢測指標中，高TAG 組TAG 水平高于對照組（P=0.002），高TAG 組apo AⅠ、HDL-C 水平均低于對照組（P=0.004，P=0.001），見表2。家系成員血糖、肝功能、腎功能檢查結(jié)果均無異常。

表2 FHTG家系成員臨床常規(guī)血脂檢測指標Tab 2 Clinical routine blood lipid detection indicators of FHTG family members

2.4 家系成員全血脂譜檢測圖譜

全血脂譜檢測圖譜將每種脂蛋白定性和定量的信息以脂蛋白峰的位置、高低及形狀表示。對比家系成員全血脂譜檢測圖譜，可見：與對照組中Ⅱ3（圖2）相比，先證者（高TAG 組Ⅱ8）血脂異常特征性的形狀為HDL 水平降低，VLDL 水平明顯升高（圖3）。VAP 方法基于LDL 最大時間值識別LDL 密度模式，小而密LDL 對應(yīng)的時間較短（≤115 s）［5］。先證者LDL 最大時間值較對照組Ⅱ3 低，LDL 的峰值更靠近小而密LDL，主要LDL 密度模式為小而密。

圖2 對照組Ⅱ3全血脂譜檢測圖譜Fig 2 Whole blood lipid profile detection of control group Ⅱ3

圖3 高TAG組Ⅱ8（先證者）全血脂譜檢測圖譜Fig 3 Whole blood lipid profile detection of high TAG group Ⅱ8(proband)

2.5 血脂亞組分檢測結(jié)果

LDL 密度模式分為B 型（小而密）、A 型（大而疏）和A/B 型（中間密度）。FHTG 家系高TAG 組LDL 密度模式均為B 型（LDL 以小顆粒致密型為主），對照組LDL 密度模式為A 型（LDL 以大顆粒疏松型為主）或A/B型（介于兩者之間），見表3。

表3 FHTG家系LDL密度模式比較Tab 3 Comparison of the LDL pattern in FHTG family

FHTG 家 系 高TAG 組TAG、VLDL、VLDL3、LDL-P 水平均高于對照組（P=0.003，P=0.033，P=0.020，P=0.043），高TAG 組HDL-C、HDL2、HDL3水平均低于對照組（P=0.000，P=0.001，P=0.001），其他指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 FHTG家系血脂亞組分比較Tab 4 Comparison of plasma lipoprotein subfractions in FHTG family

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)，中國18 歲以上人群高三酰甘油血癥患病率為12.17%，是中國人群血脂異常的主要類型［8］。研究［9-10］顯示，血脂異常已經(jīng)成為急性胰腺炎的第二大病因，而TAG 水平顯著升高［TAG≥1 000 mg/dL（11.30 mmol/L）］與血脂異常引起的急性胰腺炎密切相關(guān)。此外，有研究［11］顯示TAG水平升高也可增加心血管病的風(fēng)險。而FHTG是常見原發(fā)性高三酰甘油血癥的主要類型，應(yīng)引起重視。目前FHTG 家系臨床診斷主要依靠血清（漿）TAG 水平，但TAG 水平在個體內(nèi)及個體間變異大，同一個體多次測定時，TAG 也可能有較大差異，且TAG 受飲食和空腹時間的影響較大，因此傳統(tǒng)的普通血脂檢測存在一定的局限性，在臨床診斷時會造成一定的誤診率［12-13］。VAP 血脂分型檢測是一種高度敏感的直接檢測各類脂蛋白及其亞組分濃度的方法，可以同時檢測多種脂蛋白并能保證脂蛋白測定的準確性，從而比傳統(tǒng)的血脂指標更好地識別風(fēng)險患者［5］。

本研究通過VAP檢測一個FHTG家系成員的血脂亞組分，以了解FHTG 家系成員血脂亞組分的特征，尋找可用于診療的依據(jù)。FHTG血脂表型為TAG輕度至中度升高、TC 水平正常［1］。本家系內(nèi)高TAG 組TAG 水平明顯高于對照組，2 組之間TC 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻報道結(jié)論一致。此外，已有研究［14］表明體質(zhì)量及體脂分布狀態(tài)對血漿TAG水平影響顯著，超重（BMI≥24 kg/m2）和肥胖（BMI≥28 kg/m2）人群的TAG 水平明顯高于正常人群。本研究結(jié)果顯示高TAG 組BMI 明顯高于對照組，提示超重可增加FHTG 發(fā)生的風(fēng)險，因此，BMI 可以作為FHTG 篩查的一項指標。

本研究顯示，通過VAP技術(shù)檢測FHTG家系血脂亞組分，該家系血脂亞組分的特征是高TAG 組VLDL、VLDL3、LDL-P 水平較對照組高，HDL-C、HDL2、HDL3水平均低于對照組。高TAG 組LDL 密度模式均是小而密，提示小而密LDL 伴有較高的FHTG 風(fēng)險。且全血脂譜檢測圖譜中有血脂異常特征性的形狀，因此，結(jié)合VAP 提供的定量脂蛋白信息，圖譜輪廓的形狀有助于識別FHTG。FHTG 的常見突變類型是脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）基因的雜合失活突變，該突變導(dǎo)致VLDL核心內(nèi)的TAG水解程度降低。VLDL顆粒相對穩(wěn)定，TAG 含量增加導(dǎo)致VLDL 顆粒尺寸增加。大的VLDL 顆粒不是LPL的最佳底物，因此水解速度很慢，導(dǎo)致循環(huán)中富含TAG的大體積VLDL顆粒增加［3］。本研究FHTG家系中高TAG 組VLDL 和VLDL3較對照組高，與已有結(jié)論一致。

目前，關(guān)于FHTG 是否為心血管疾病的獨立危險因素尚存有爭議［15］。心血管疾病的殘余風(fēng)險（通過降血脂藥物的有效治療后，雖然患者LDL-C 水平已達標，但部分患者仍可能出現(xiàn)心血管疾病相關(guān)事件）與TAG 水平增高密切相關(guān)［16-17］。也有研究［18］發(fā)現(xiàn)，TAG 水平增高與心血管疾病的發(fā)生無明顯相關(guān)。在本研究中，通過測定血脂亞組分、脂蛋白膽固醇含量及脂蛋白顆粒濃度，發(fā)現(xiàn)FHTG 家系中高TAG 組血清TAG、VLDL、VLDL3、LDL-P 較對照組顯著升高，HDL-C、HDL2、HDL3水平較對照組顯著降低，且高TAG 組均為小而密LDL。而已有的大量研究［19-21］表明VLDL、小而密LDL、HDL-C、HDL2、HDL3均與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TAG 輕至中度升高常反映VLDL 及其殘粒（顆粒更小的VLDL）增多，這些殘粒脂蛋白由于顆粒變小，可能具有直接致動脈粥樣硬化的作用［4］。VLDL中的TAG和HDL、LDL 中的膽固醇酯進行交換，引起血清中小而密LDL 顆粒的濃度升高和HDL-C 水平降低，脂質(zhì)交換后生成的小而密LDL 顆粒具有很強的致動脈粥樣硬化作用。小而密LDL 顆粒小，更容易進入動脈內(nèi)膜下層，并滯留在動脈管壁，加之小而密LDL的清除過程緩慢，進一步延長了在動脈管壁的滯留時間，由此誘導(dǎo)巨噬細胞形成泡沫細胞，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊形成［22］。動脈粥樣硬化是腦梗死的主要原因及重要因素［23］，且本實驗中家系成員Ⅰ2、Ⅱ4（2015 年）均已發(fā)生腦梗死，進一步表明FHTG 可能為心血管疾病的獨立危險因素。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，F(xiàn)HTG 與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，這提示血脂亞組分的測定對于FHTG 及心血管疾病的診斷有重要意義。

由于“三口之家”的小家系日趨成為家庭主體，符合要求的家系難以獲取，家系資源更顯珍貴，所以今后有必要進一步加快FHTG 等家系收集，以明確血脂亞組分的特征，進而闡明FHTG 與動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的關(guān)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)除臨床常用的TAG 和HDL-C 外，VLDL3、VLDL、LDL-P、小而密LDL、HDL2、HDL3也有助于FHTG 的診斷和鑒別診斷，并可對疾病的風(fēng)險評估提供指導(dǎo)建議。血脂亞組分測定可能為今后精準檢驗提供思路和方法。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過蘭州大學(xué)第一醫(yī)院科學(xué)倫理委員會的審核批準（文件號LDYYLL2021-285，日期2021-08-30）。所有實驗過程均遵照《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of First Hospital of Lanzhou University（Approval Letter No. 2021-285， dated 2021-08-30）， and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofGood Clinical Practice. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

何志潔、何津春、張燕培參與了實驗設(shè)計；何志潔、何津春、張燕培、王耀東、王占科參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by HE Zhijie， HE Jinchun and ZHANG Yanpei. The manuscript was drafted and revised by HE Zhijie， HE Jinchun， ZHANG Yanpei， WANG Yaodong and WANG Zhanke.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-27

·Accepted：2022-04-10

·Published online：2022-04-28