應(yīng)用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)研究B 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子T-bet的調(diào)控作用

韓夏夏，顧霜霜，戴 黛，沈 南

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科，上海風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海 200127

B 淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，可以識(shí)別特異性的抗原，一方面通過(guò)抗體的中和作用，減少機(jī)體與病原體的接觸；另一方面抗體可以活化下游巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒作用（antibodydependent cellular cytotoxicity，ADCC），參與免疫反應(yīng)［1］?？贵w發(fā)揮效應(yīng)功能不僅依賴于抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab）識(shí)別抗原，更需要通過(guò)抗體Fc（fragment crystallizable）端結(jié)合能表達(dá)抗體Fc 受體的效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮差異性的免疫調(diào)控功能?？贵w的Fc 端決定了抗體的類型［2-3］，F(xiàn)c 端的轉(zhuǎn)變，即抗體的類別轉(zhuǎn)換，由細(xì)胞本身和微環(huán)境決定?？乖瓕?duì)B 細(xì)胞的激活、微環(huán)境中細(xì)胞因子的刺激等，最終由多種調(diào)控元件協(xié)同作用介導(dǎo)重鏈（IgH）位點(diǎn)的DNA 刪除實(shí)現(xiàn)抗體的類別轉(zhuǎn)換［1，4］。例如，受γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子T-bet （編碼基因?yàn)門-box 21，縮寫Tbx21）是IgG2a/c 類別轉(zhuǎn)換中重要的調(diào)控分子，在B 細(xì)胞中敲除Tbx21基因，能夠有效抑制IgG2a/c 抗體產(chǎn)生［5］。然而T-bet 對(duì)B 細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換的精確調(diào)控機(jī)制仍不明確。

目前對(duì)B細(xì)胞調(diào)控分子和信號(hào)通路的研究大多通過(guò)基因工程的方式實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)構(gòu)建條件性基因敲除小鼠的方法主要是通過(guò)Loxp 位點(diǎn)和Cre 重組酶實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)B細(xì)胞中定向基因敲除，研究基因在體內(nèi)外對(duì)B 細(xì)胞的調(diào)控功能；但該方法不僅花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)成本較高，而且構(gòu)建的模型小鼠還存在Cre 酶編碼序列部分被替代的可能，影響基因敲除的效率［6］。常規(guī)的體外功能研究技術(shù)包括：①通過(guò)小干擾RNA、微RNA 和發(fā)夾RNA 進(jìn)行分子敲低，但其受到敲除效果穩(wěn)定性、瞬時(shí)性和敲除效率的影響。②通過(guò)病毒遞送過(guò)表達(dá)載體，但其受到基因大小的限制。近些年CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，得以應(yīng)用于小鼠原代免疫細(xì)胞的基因編輯，可以靶向特定的目的基因，為研究分子轉(zhuǎn)錄提供了強(qiáng)有力的工具［7］。課題組前期成功利用Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠和小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）反轉(zhuǎn)錄病毒載體成功實(shí)現(xiàn)原代T細(xì)胞的基因敲除［8］。但該系統(tǒng)運(yùn)用到B 細(xì)胞中時(shí)，需要考慮到B 細(xì)胞分化、激活條件的特異性，優(yōu)化質(zhì)粒遞送體系，才能在B細(xì)胞基因的研究中也成功實(shí)現(xiàn)基因編輯。

本研究通過(guò)優(yōu)化病毒感染條件，利用濃縮的高滴度反轉(zhuǎn)錄病毒感染充分活化的小鼠原代B細(xì)胞，進(jìn)行高效的基因編輯。以原代B細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子T-bet 為例，利用該系統(tǒng)驗(yàn)證敲除Tbx21基因?qū)贵wIgG2c 產(chǎn)生的抑制作用，旨在為B 細(xì)胞基因功能研究提供一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、高效的基因編輯系統(tǒng)和研究手段。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 8～10 周齡C57BL/6J 小鼠（JAX000664）和Cas9-EGFP 小鼠（JAX026175），雌性，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自美國(guó)杰克森實(shí)驗(yàn)室。所有實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0013。小鼠自由飲食，飼料用60Co 輻照殺菌。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24 ℃，空氣相對(duì)濕度40%～60%，光照周期為12 h/12 h。

Plat-E 病毒包裝細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。采用含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 的DMEM 培養(yǎng)基，放置在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞密度，達(dá)到約80%密度即可傳代。本實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞為第3～4代指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好。

1.1.2 主要試劑及儀器 小鼠B 細(xì)胞分選試劑盒、LS 分選柱（Miltenyi，德國(guó)），抗B 細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）抗體（Jackson Immunoresearch，英國(guó)），抗小鼠CD40 抗體（Biolegend，美國(guó)），Toll 樣受 體 （Toll-like receptor， TLR） 激 動(dòng) 劑 R848（InvivoGen，美國(guó)），胰蛋白酶、Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基、DMEM、RPMI-1640、FBS、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、丙酮酸鈉、谷氨酰胺和抗生素（Gibco，美國(guó)），BD Cytofix/Cytoperm?細(xì)胞固定/破膜試劑盒（BD Biosciences，美國(guó)），Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑（ThermoFisher Scientific，美國(guó)），T4 連接酶（NEB，美國(guó)），血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（天根，中國(guó)），小鼠免疫球蛋白面板 （SBA Clonotyping System-C57BL/6-HRP，SouthernBiotech，美國(guó)），APC 標(biāo)記的抗小鼠/人T-bet抗體（Clone 4B10）、PE/Cyanine 5 標(biāo)記的抗小鼠CD19 抗體（Clone 6D5）、死活細(xì)胞染料（Zombie Aqua?Fixable Viability Kit，Cat#423102）、生物素標(biāo)記的抗小鼠CD16/32 抗體（封閉抗體，Clone 93）（BioLegend，美國(guó)）。U6-PGK-Puro-BFP 載體由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。

超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、DNA Thermal Cycler 9700 PCR 儀（Thermo Scientific，美國(guó)）、Centrifuge 5801R 離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），流式細(xì)胞分選儀Aria Ⅲ、 流 式 細(xì) 胞 分 析 儀Fortessa X-20 （BD Biosciences，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因集富集分析 使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 軟件（Broad Institute）進(jìn)行分析。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）得到的基因表達(dá)譜（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）來(lái)自于GEO 公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集GSE84948 和GSE83697。本研究分析所用的功能基因集均來(lái)源于Molecular Signatures Database（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）。對(duì)于分析結(jié)果，一般認(rèn)為|NES|>1，NOMP-value<0.05，F(xiàn)DRq-value<0.25（NES 是normalized enrichment score 的 縮 寫，NOM 是nominal 的 縮 寫，F(xiàn)DR 是false discovery rate 的縮寫）的通路下的基因集合是有意義的。

1.2.2 sgRNA/Cas9 表達(dá)載體的構(gòu)建 sg-Tbx21和sg-NC 序列通過(guò)在線網(wǎng)站（http：//chopchop.cbu.uib.no/）設(shè)計(jì)，以單鏈的形式合成（序列見(jiàn)表1），并在以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到驗(yàn)證［9-10］。選擇U6-PGK-Puro-BFP為sgRNA/Cas9 的表達(dá)載體，將其進(jìn)行酶切電泳、回收得到線性載體。將合成的sgRNA 體外復(fù)性得到雙鏈后，通過(guò)T4 連接酶與上述酶切后的線性載體4 ℃連接過(guò)夜，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，次日挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功的菌株抽提質(zhì)粒備用。

表1 sgRNA功能序列及單鏈引物Tab 1 sgRNA functional sequences and single strand primers

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝 提前1 d，將8×106個(gè)Plat-E細(xì)胞種植在10 cm 培養(yǎng)皿，使用Lipo2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。取750 μL Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基，加入15 μg sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒載體；另取750 μL Opti-MEM 加入30 μL Lipo2000，室溫孵育5 min。將這2步所得的混合液混勻，室溫放置15 min 后，加入培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染6 h后細(xì)胞換液，48 h后收集上清液，0.45 μm孔徑細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后，4 ℃下20 133×g離心濃縮2 h，置于4 ℃冰箱備用，1周內(nèi)使用。

1.2.4 B 細(xì)胞分離及體外激活培養(yǎng) 分離8～10 周齡的C57BL/6J 小鼠和Cas9-EGFP 小鼠脾臟，經(jīng)研磨和40 μm 孔徑濾網(wǎng)過(guò)篩后得到細(xì)胞混合液，離心后裂解紅細(xì)胞。按照小鼠B細(xì)胞分選試劑盒說(shuō)明書分離小鼠初始B 細(xì)胞。每107個(gè)脾臟總細(xì)胞用40 μL 預(yù)冷的磁珠活化細(xì)胞分選（MACS）緩沖液重懸，加入10 μL生物素標(biāo)記的混合抗體（biotin-antibody cocktail），混勻，4 ℃反應(yīng)5 min。然后按每107個(gè)脾臟總細(xì)胞加入30 μL 預(yù)冷的MACS 緩沖液，再加入20 μL 抗生物素磁珠，混勻，4 ℃反應(yīng)10 min。等待間隙，將LS分選柱放置在磁力架上，用1 mL 的MACS 緩沖液預(yù)先潤(rùn)洗2～3 次。將細(xì)胞加到LS 柱里，用15 mL 離心管收集LS 柱流下的細(xì)胞液，再用MACS 緩沖液沖洗LS 柱3 次。將所有LS 柱流下的液體于4 ℃下400×g離心5 min。去上清液后，培養(yǎng)基重懸進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，之后于24 孔板（1×106個(gè)/孔） 內(nèi)激活B 細(xì)胞，用500 ng/mL R848、1 μg/mL抗CD40抗體和1 μg/mL抗BCR抗體刺激24 h。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠B細(xì)胞 收取激活后的B細(xì)胞，計(jì)數(shù)，再次鋪板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，并加入200 μL病毒和聚凝胺的混合液；32 ℃，1 260×g離心90 min。離心結(jié)束后，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。6 h 后棄去病毒上清液，加入B 細(xì)胞分化培養(yǎng)基（RPMI-1640、10%滅活FBS、10 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸、NEAA、2 mmol/L 丙酮酸鈉、0.05 mmol/L β-巰基苯酚、2 mmol/L谷氨酰胺），體外誘導(dǎo)3 d，進(jìn)行后續(xù)流式分選檢測(cè)敲除效率。

1.2.6 免疫細(xì)胞流式染色與分析 收集分化后的B細(xì)胞，離心去上清液，用MACS 緩沖液重懸，制備成單細(xì)胞懸液，配置細(xì)胞表面CD19 抗體、死活細(xì)胞染料與封閉抗體的混合液，每個(gè)樣本加入50 μL 染色體系，4 ℃避光反應(yīng)20 min。MACS 緩沖液清洗后進(jìn)行流式檢測(cè)。在表面染色之后，用細(xì)胞固定/破膜試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和破膜，每個(gè)樣本加入50 μL 固定液，4 ℃反應(yīng)20 min，再進(jìn)行核內(nèi)T-bet染色，加入T-bet 抗體室溫避光反應(yīng)30 min。離心去上清液后用檢測(cè)液重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。用FlowJo 軟件分析結(jié)果。

1.2.7 檢測(cè)靶基因敲除效率 使用細(xì)胞抽提基因組DNA 試劑盒提取經(jīng)細(xì)胞分選和病毒感染的B 細(xì)胞基因組DNA，針對(duì)sg-Tbx21靶向區(qū)域的上下游設(shè)計(jì)引物（表2），PCR 擴(kuò)增待檢測(cè)DNA 片段。PCR 條件為94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。對(duì)得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)通，利用ICE CRISPR 分析工具計(jì)算基因敲除效率。

表2 PCR引物序列Tab 2 Primers for PCR

1.2.8 ELISA 法檢測(cè)抗體豐度 使用小鼠免疫球蛋白面板，按說(shuō)明書操作檢測(cè)IgG2c、IgG3 和IgM 3 個(gè)類別抗體的滴度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料用±s表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-bet促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換相關(guān)通路的上調(diào)

小鼠的體液免疫反應(yīng)通常分為以Th1 細(xì)胞因子IFN-γ 為主的偏向于IgG2a/c 抗體產(chǎn)生的反應(yīng)，以及以Th2 細(xì)胞因子IL-4 為主的偏向于IgG1 抗體產(chǎn)生的反應(yīng)［11］。IFN-γ 下游的T-bet 是主導(dǎo)IgG2a/c 類別轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)錄因子［12-13］。通過(guò)挖掘GEO 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)集GSE84948，對(duì)IFN-γ 誘導(dǎo)分化的B 細(xì)胞（Be1 細(xì)胞）與IL-4 誘導(dǎo)分化的B 細(xì)胞（Be2 細(xì)胞）的RNA-seq 結(jié)果進(jìn)行重分析，發(fā)現(xiàn)IFN-γ 誘導(dǎo)分化后，轉(zhuǎn)錄因子Tbx21基因的表達(dá)水平明顯上升，Ighm（immunoglobulin heavy constant mu）、Ighg［immunoglobulin heavy chain （gamma polypeptide） ］ 和Ighg3（immunoglobulin heavy constant gamma 3） 的水平也明顯上升（圖1A）。GSEA 結(jié)果顯示，與Be2 細(xì)胞相比，DNA 重組（DNA recombination） 和IgG 同種型轉(zhuǎn)換（isotype switching to IgG isotypes）通路在Be1 細(xì)胞中明顯上調(diào)（圖1B）。通過(guò)對(duì)GSE83697 數(shù)據(jù)集中IFN-γ 誘導(dǎo)分 化 的B 細(xì) 胞（Be1 細(xì) 胞） 和T-bet 敲 除B 細(xì) 胞（Be1.Tbet-ko 細(xì)胞）的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Be1.Tbet-ko 細(xì)胞中，DNA 重組通路明顯下調(diào)（圖1C）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，IFN-γ 誘導(dǎo)的B 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的T-bet 是調(diào)控B 細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換的重要轉(zhuǎn)錄分子［14］。

圖1 T-bet參與調(diào)控抗體分泌細(xì)胞的抗體類別轉(zhuǎn)換Fig 1 T-bet involved in regulating antibody isotype switching in antibody secreting cells

2.2 構(gòu)建高效編輯原代B 細(xì)胞基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)

為了建立用于小鼠原代B 細(xì)胞基因功能研究的高效CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，我們借鑒了前期成功構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體（U6-sgRNA-PGKPuro-BFP）和Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠［8，15］，并且進(jìn)一步優(yōu)化感染條件。我們分離小鼠原代B 細(xì)胞，加入R848、抗CD40 抗體和BCR 共培養(yǎng)激活24 h 后收取細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)激活后B 細(xì)胞的前向和側(cè)向散射光（FSC 和SSC），發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激后的B 細(xì)胞明顯變大（圖2A）。除此之外，感染細(xì)胞時(shí)病毒消耗量較大，因此獲得高滴度的病毒顆粒也是提高病毒感染效率的重要因素。由于工具細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、目的基因大小、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染效率等都會(huì)影響病毒包裝效率，為了獲得穩(wěn)定的高滴度病毒顆粒，且減少直接收集的病毒上清液對(duì)后續(xù)感染細(xì)胞活性的影響，本研究對(duì)原先感染操作進(jìn)行優(yōu)化：在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后收取病毒上清液，高速離心后獲得病毒濃縮液，感染已激活的B 細(xì)胞。結(jié)果顯示，與未優(yōu)化組（用直接收集的病毒上清液感染未激活的B 細(xì)胞）相比，優(yōu)化組細(xì)胞活性較好，藍(lán)色熒光蛋白（BFP）陽(yáng)性細(xì)胞比例可達(dá)到69.8%（圖2B）。表明原代小鼠B細(xì)胞充分激活并采用濃縮后的高滴度病毒顆粒感染可具有較高的感染效率。

圖2 編輯原代B細(xì)胞基因CRISPR/Cas9系統(tǒng)的感染條件優(yōu)化Fig 2 Optimization of infection conditions of CRISPR/Cas9 system for editing genes of primary B cells

2.3 反轉(zhuǎn)錄病毒感染B細(xì)胞后敲除T-bet的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該系統(tǒng)是否能用于B 細(xì)胞的基因敲除，對(duì)設(shè)計(jì)合成的sgRNA 進(jìn)行克隆和病毒包裝。分離Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠B 細(xì)胞，激活24 h 后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒感染。3 d 后進(jìn)行流式分選時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染B 細(xì)胞（CD19+GFP+BFP+）的比例可達(dá)65.7%（圖3A）。對(duì)流式分選后的感染B 細(xì)胞抽提基因組DNA，并圍繞sg-Tbx21靶向位置上下游設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后送測(cè)序。結(jié)果顯示：目的sgRNA 在T-bet 靶向序列位點(diǎn)上引入indel 效率為78%，T-bet 分子的敲除效率約為59%（圖3B），表明利用該系統(tǒng)可以有效地對(duì)小鼠原代B細(xì)胞進(jìn)行靶基因敲除。

圖3 反轉(zhuǎn)錄病毒感染B細(xì)胞后T-bet敲除效率檢測(cè)Fig 3 T-bet knockout efficiency of T-bet in the retrovirus-infected B cells

2.4 T-bet在B細(xì)胞中參與調(diào)控IgG2c的產(chǎn)生

為了進(jìn)一步研究T-bet 在B 細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換中的作用，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在反轉(zhuǎn)錄病毒感染后的B 細(xì)胞中加入IFN-γ 等漿細(xì)胞分化所需的細(xì)胞因子和抗體進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞核內(nèi)T-bet 的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與sg-NC 組相比，sg-Tbx21組中，感染后的B 細(xì)胞中T-bet 的表達(dá)水平明顯降低（圖4A）。漿細(xì)胞分化完成后，收集細(xì)胞上清液，通過(guò)ELISA 檢測(cè)各個(gè)類別抗體豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-bet被敲除后IgG2c 的水平明顯降低，IgM和IgG3 的水平未有明顯的變化（圖4B）。表明T-bet在IgG2c的產(chǎn)生過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。

圖4 B細(xì)胞中T-bet被敲除后對(duì)抗體IgG2c水平的影響Fig 4 Effect of T-bet knockout in B cells on IgG2c production

3 討論

免疫細(xì)胞中有效并且可及的基因干預(yù)手段對(duì)于研究免疫細(xì)胞的一些特征和功能具有重要意義，但是與T 細(xì)胞基因工程工具的廣泛開(kāi)發(fā)不同，應(yīng)用于B 細(xì)胞上的干預(yù)手段相對(duì)缺失。雖然近年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，得以應(yīng)用于小鼠原代免疫細(xì)胞基因編輯，但仍存在很多局限性，如編輯效率、脫靶效應(yīng)、同源重組效率低下等［16］。CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)依賴于sgRNA 和靶DNA 的堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)識(shí)別靶位點(diǎn)［17］，未激活的原代免疫細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄本開(kāi)放程度較低，sgRNA 序列整合到基因組的能力較低，從而導(dǎo)致基因編輯效率較低，因此細(xì)胞充分活化是提高原代免疫細(xì)胞基因編輯效率的一個(gè)重要前提。除此之外，細(xì)胞活化后，細(xì)胞變大，與病毒顆粒接觸的表面積增加，有利于病毒遺傳物質(zhì)整合到細(xì)胞基因組上，提高了Cas9 蛋白-sgRNA 復(fù)合物靶向結(jié)合到編輯位點(diǎn)的效率。與T 細(xì)胞類似，B 細(xì)胞激活也需要同步信號(hào)。本研究中通過(guò)BCR、CD40 和TLR 信號(hào)協(xié)同作用，可以充分動(dòng)員下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase， MAPK） 和 核 因 子κB（nuclear factor κB，NF-κb），促進(jìn)B 細(xì)胞的活化和功能［18-19］。在提高感染效率方面，我們通過(guò)濃縮病毒代替直接收集的病毒上清液，一方面是為了獲得穩(wěn)定的高滴度病毒顆粒，另一方面是因?yàn)橐话悴《臼占瘯r(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損耗較大，且含有多種代謝產(chǎn)物，直接培養(yǎng)感染細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，優(yōu)化組無(wú)論是細(xì)胞活性還是感染效率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未優(yōu)化組。并以敲除T-bet為例，利用ICE CRISPR 分析工具檢測(cè)功能基因的編輯效率，并檢測(cè)感染后B細(xì)胞在漿細(xì)胞分化條件誘導(dǎo)下，上清液中各個(gè)抗體類型的豐度，分析結(jié)果顯示T-bet 敲除效率大大提高，并且有效抑制IgG2c型抗體的產(chǎn)生。

B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體發(fā)揮生物學(xué)作用既依賴Fab 端的識(shí)別，更受到類別轉(zhuǎn)換后的Fc 端類型及其下游效應(yīng)細(xì)胞的影響。通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中基因表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn)，IFN-γ信號(hào)和下游的T-bet分子可促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換信號(hào)通路的活化［12-13］。利用優(yōu)化的原代B 細(xì)胞病毒感染系統(tǒng)，高效地將sgRNA 導(dǎo)入到表達(dá)Cas9蛋白的B 細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)Tbx21基因的有效編輯；并且在編輯后的B 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T-bet缺陷確實(shí)抑制了IgG2c抗體類型的轉(zhuǎn)換。這些結(jié)果進(jìn)一步為T-bet 分子參與B 細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換的調(diào)控提供了證據(jù)。除此之外，T-bet 分子被發(fā)現(xiàn)在衰老/自身免疫相關(guān)B 細(xì)胞（age/autoimmune-associated B cell， ABC） 中 高 表 達(dá)，ABC 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在多種自身免疫疾病、感染和衰老中均有重要功能的新型B 細(xì)胞亞群，T-bet 是調(diào)控ABC 發(fā)育和功能的重要轉(zhuǎn)錄因子［20-21］。本研究所構(gòu)建的Cas9 介導(dǎo)的原代B 細(xì)胞基因編輯手段，將有助于深入研究T-bet分子對(duì)B細(xì)胞功能的研究。

綜上，本研究使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，通過(guò)優(yōu)化感染條件，利用濃縮的高滴度反轉(zhuǎn)錄病毒感染活化增殖的小鼠原代B 細(xì)胞，高效編輯小鼠原代B 細(xì)胞中的靶基因，以T-bet 為例，驗(yàn)證了敲除T-bet 能夠抑制B 細(xì)胞IgG2c 抗體類別的產(chǎn)生，極大地發(fā)展了原代B 細(xì)胞中的基因干預(yù)手段，未來(lái)可有效利用該系統(tǒng)研究B 細(xì)胞基因功能及抗體產(chǎn)生過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準(zhǔn)和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（編號(hào)：2019-0103）。所有動(dòng)物相關(guān)操作均按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Institutional Animal Care and Use Committee at Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（Approval Letter No. 2019-0103）， and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Institutional Animal Care and Use Committee at Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

沈南、戴黛參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；沈南、戴黛、韓夏夏參與了論文的寫作和修改；韓夏夏、顧霜霜參與了實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by SHEN Nan and DAI Dai. The manuscript was drafted and revised by SHEN Nan， DAI Dai and HAN Xiaxia.The data was acquired and analyzed by HAN Xiaxia and GU Shuangshuang. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-24

·Accepted：2022-04-25

·Published online：2022-04-28