氨基甲酸乙酯水解酶異源表達及酶學性質(zhì)分析

高孝，高潔，劉曉宇，王中選，劉慶濤，桑亞新*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種廣泛存在于發(fā)酵食品和酒精飲料[1-3]中屬于2A類的致癌物質(zhì)[4]，并且在食品的發(fā)酵及貯藏過程中均可由其前體物質(zhì)所產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)[5-6]。目前，人們常常通過優(yōu)化食品的發(fā)酵工藝[7-8]、對釀酒酵母進行基因改造[9-11]以及微生物酶法（包括脲酶[12-14]、氨基甲酸乙酯水解酶[15-17]）實現(xiàn)對氨基甲酸乙酯的控制，由于微生物酶法可直接作用于底物，對底物的降解效率高并且不會對環(huán)境造成影響，從而使其在降解EC方面具有很好的優(yōu)勢[18-19]。脲酶可以通過水解EC的前體物質(zhì)尿素從而實現(xiàn)對終產(chǎn)物EC含量的控制[20]，但是EC一旦生成將很難在食品中消除[21]，而氨基甲酸乙酯水解酶（urethanase，UH）可以直接作用于EC使其水解為無害的物質(zhì)，因此其在實際的應用過程中具有良好的前景[22]。

2006 年，Akutsu-Shigeno等[21]從馬紅球菌（Rhod-ococcus equistrain TB-60）中發(fā)現(xiàn)了可以降解EC的蛋白質(zhì)，并克隆了該蛋白的基因序列（GenBank：DD320008.1），成功實現(xiàn)了其在E.coli中的異源表達。卜攀攀等[23]在2013年從小鼠的胃部獲得了一株具有UH活性的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），驗證該菌所產(chǎn)的EC水解酶對于氯化鈉具有較好的耐受性。隨后李京京等[24]在2014年從小鼠腸道篩選得到一株賴氨酸芽孢桿菌，證明其具有對EC進行降解的功能，并對所產(chǎn)的EC水解酶進行分離純化，通過N端測序獲得了該EC水解酶的基因序列（GanBank：KU353448.1），隨后在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中均實現(xiàn)了該酶的活性表達，但該酶的耐酸性以及耐乙醇性較差。2019年，Masakik等[25]在Candida parapsilosis中獲得了具有編碼EC水解酶的基因序列（GanBank：LC511748.1），并實現(xiàn)了該基因在釀酒酵母中的表達，且該酶對乙醇具有一定耐受性。

本研究根據(jù)來源于長孢洛德酵母菌屬的UH蛋白序列，并依據(jù)大腸桿菌系統(tǒng)的密碼子偏好性來合成該UH蛋白的目的基因，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中進行異源表達，將得到的粗酶液進行細胞破碎后經(jīng)鎳柱親和層析純化，研究重組酶的酶學性質(zhì)[26]，以期為在實際應用中降解氨基甲酸乙酯提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coli BL21（DE3）（過表達目的基因的宿主菌）、誘導型表達質(zhì)粒pET-30a（＋）：由河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院微生物實驗室保存；含有氨基甲酸乙酯水解酶基因的E.coli DH5α：金唯智生物科技（蘇州）有限公司。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒小提試劑盒：全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉：英國Oxiod公司；氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、丁基氨基甲酸酯、乙酰胺、丁酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、煙酰胺：上海麥克林生化科技有限公司。以上化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-IID型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Thermo Cel I恒溫金屬?。汉贾莶┤湛萍脊煞萦邢薰荆籅G-Power600型電泳儀：上海貝晶生物技術(shù)有限公司；1500酶標儀：賽默飛爾科技公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Tanon-4600SF凝膠成像系統(tǒng)：北京原平皓生物科技有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表達載體的構(gòu)建

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中來源于Lodderomyces elongisporus的UH的氨基酸序列（XP_001524600.1），在序列的5’端和3’端分別添加限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位點，在不改變氨基酸序列的前提下根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對序列進行優(yōu)化后合成目的基因，隨后連接至pET-30a（＋）載體上，命名為pET-30a（＋）-UH，并轉(zhuǎn)化至克隆菌株E.coli DH5α中。

1.3.2 重組大腸桿菌的誘導表達

參照質(zhì)粒小提試劑盒提取克隆菌株中的表達載體，將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞中，隨后涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取重組菌接入LB液體培養(yǎng)基中過夜活化后，以1%的接種量將菌液接種至LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，至OD600值約為0.6～0.8時，加入終濃度為0.1mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液，在30℃條件下繼續(xù)誘導培養(yǎng)。

1.3.3 氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化

將表達后的菌液以12 000 r/min離心10 min后收集發(fā)酵誘導的細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體后放于冰水浴上超聲破碎，將破碎液于4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為所需的粗酶液。使用鎳柱親和層析法純化重組氨基甲酸乙酯水解酶，使用截留分子量為3.3 kDa的透析袋透析，隨后經(jīng)過截留分子量為10 kDa的超濾離心管離心后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 檢測分析，以確定洗脫蛋白是否為目的蛋白及其純化程度。

1.3.4 重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的測定

根據(jù)Berthelot反應顯色法，在波長625 nm下測定吸光值計算酶活。在0.2 mL含200 mmol/L氨基甲酸乙酯的磷酸鹽緩沖液（對照組為磷酸鹽緩沖液）中加入0.2 mL經(jīng)過適當稀釋的酶液，在37℃恒溫水浴箱中反應20 min后，立即加入0.2 mL終止劑終止反應，混勻后依次加入0.2 mL顯色劑Ⅰ、0.2 mL顯色劑Ⅱ，搖勻，37℃水浴繼續(xù)保持10 min。酶活定義：在37℃、pH7.4條件下每分鐘分解底物EC產(chǎn)生1 μmol NH4+所需酶量為1個酶活力單位。

1.3.5 氨基甲酸乙酯水解酶酶學性質(zhì)分析

1.3.5.1 最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性

將純化后的酶液與底物分別在 20、25、30、37、40、45、50、55、60℃條件下測定酶活力，以測得的最高活力為100%，計算出其余溫度下的相對酶活，確定該酶的最適反應溫度。將純化后的酶液分別于20、30、37、40、45、50℃條件下恒溫放置1 h后測定殘余酶活，以反應所測的最高酶活力為100%，探討酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.2 最適反應pH值及pH值穩(wěn)定性

將等量的純酶液置于不同 pH 值（4、5、6、7、8、9）的緩沖液中，于37℃反應測定酶活力，考察該酶在不同pH值條件下的酶活力，確定該酶的最適pH值。將等量的酶液分別與不同 pH 值（4、5、6、7、8、9）的緩沖液在4℃放置4 h后，測定殘余的酶活力，考察酶在不同pH值下的穩(wěn)定性。

1.3.5.3 酶的乙醇耐受性以及NaCl耐受性

將純化的酶液加入含底物不同體積分數(shù)（0%～30%）的乙醇溶液中，于37℃反應后測定酶的活力，觀察不同體積分數(shù)乙醇溶液對酶活力的影響。將酶液加入含底物不同質(zhì)量濃度（0%～20%）的NaCl溶液中，反應結(jié)束后測定酶的殘余酶活力，觀察酶對NaCl的耐受性。

1.3.5.4 底物特異性

在最適的條件下，將酶液分別與不同底物（氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、丁基氨基甲酸酯、乙酰胺、丁酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、煙酰胺）反應測定酶活力，以酶對氨基甲酸乙酯的酶活為100%，換算得到酶對其他底物的降解活性。

1.3.5.5 金屬離子與化學試劑對酶活力的影響

將酶液與終濃度為1 mmol/L的不同金屬離子（Cu2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Fe3+） 以及終濃度為0.1 mmol/L（0.1%）的化學試劑混合，于37℃保溫5 min后加入底物測定酶的殘余酶活力，研究金屬離子與化學試劑對酶活力的影響。

1.3.5.6 酶的反應動力學性質(zhì)

將純化后的酶液與不同終濃度（5mmol/L～50mmol/L）的氨基甲酸乙酯底物作用，在37℃磷酸鹽緩沖液中測定酶反應的初速度，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出酶對底物的Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體的構(gòu)建

本文采用pET-30a（＋）質(zhì)粒作為克隆及表達載體，克隆菌株為E.coli strain DH5α，因此挑取單菌落進行過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進行酶切處理，對目的基因的大小進行驗證。取雙酶切之后的反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electropherogram of recombinant plasmid double digestion product

如圖1所示，1號泳道代表未經(jīng)雙酶切處理的重組質(zhì)粒，2號泳道代表經(jīng)過內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ處理的重組質(zhì)粒，因此顯示共有兩條帶，其中第一條為線性pET-30a（＋）質(zhì)粒，大小為5 231 bp，另外一條為目的基因，大小為1 703 bp，表明目的基因與載體質(zhì)粒連接成功,可以進行后續(xù)的轉(zhuǎn)化表達。

2.2 重組氨基甲酸乙酯水解酶的誘導表達及純化

對重組菌誘導后的表達蛋白進行超聲破碎，經(jīng)SDS-PAGE進行蛋白條帶檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 重組氨基甲酸乙酯水解酶分離純化過程SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis in the purification process of recombinant urethanase

從圖2可以看出，在70 kDa附近有明顯的目的條帶，粗酶液經(jīng)親和層析柱純化后得到目的蛋白條帶，粗酶液的比活力為4.52 U/mg，純化后的酶比活力達到9.86 U/mg，是純化前的2.18倍。

2.3 溫度與pH值對重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響

不同溫度和pH值下的重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活力結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度和pH值對重組氨基甲酸乙酯水解酶的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the activity of recombinant urethanase

由圖3A可知，重組水解酶的酶活隨著溫度的逐漸升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，重組酶在20℃～40℃范圍內(nèi)相對活性在50%以上，最適反應溫度為30℃；由圖3B可知，重組酶在40℃以下處理1 h后，仍能保持70%以上的酶活力，高于40℃后，酶活力幾乎完全喪失，結(jié)果表明，重組酶在20℃～40℃的情況下具有良好的反應活性以及熱穩(wěn)定性。

由圖3C可知，在pH4～9條件下，隨著pH值的升高，酶活力呈先上升后下降的趨勢。在pH7時，酶活力最高，為UH的最適反應pH值，最適pH值范圍為6～8，相對活力在50%以上。將該酶分別在pH值為4～9條件下，4℃放置4 h后測定酶活力，如圖3D所示，當酶在pH值為6～8時，酶活力基本穩(wěn)定，能維持50%以上的酶活力，當pH值低于6或大于8時，酶活力迅速下降。該結(jié)果表明，重組酶在中性范圍內(nèi)具有較好的反應活性以及穩(wěn)定性。

2.4 乙醇與鹽對氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響

乙醇體積分數(shù)和NaCl質(zhì)量濃度對氨基甲酸乙酯水解酶的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)和NaCl質(zhì)量濃度對氨基甲酸乙酯水解酶的影響Fig.4 Effects of ethanol volume fraction and NaCl concentration on the activity of urethanase

由圖4A可知，當乙醇體積分數(shù)為10%時，UH的相對酶活在30%左右，當乙醇體積分數(shù)大于20%時，殘余酶活力不到原來的10%。由圖4B可知，當NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.5%時，UH的酶活力只有初始酶活力的20%。結(jié)果表明，與已報道過的氨基甲酸乙酯水解酶[15-17]相比，UH對低質(zhì)量分數(shù)的NaCl以及低體積分數(shù)乙醇具有一定耐受性。

2.5 金屬離子與化學試劑對重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響

不同的金屬離子與化學試劑對氨基甲酸乙酯水解酶的酶活影響見圖5。

圖5 金屬離子和化學試劑對重組氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影響Fig.5 Effects of metal ions and chemicals on the activity of recombinant urethanase

由圖5A可知，除了Mg2+外其它金屬離子對UH的酶活都有不同程度的抑制作用，其中Cu2+、Zn2+、Fe3+使酶活力降至原來的10%以下，其中Cu2+幾乎能完全抑制酶活。此結(jié)果與Patel等[27]研究得到的Cu2+可加快氧化自身半胱氨酸分子，從而使得二硫鍵或亞磺酸在分子內(nèi)或分子間形成，最終導致酶活力受到嚴重抑制結(jié)果一致。由圖5B可知，在不同種表面活性劑和抑制劑存在的情況下，酶活力依然在80%以上，且在表面活性劑吐溫-20、吐溫-80以及曲拉通X-100存在時，酶活力均在95%以上，表明其對酶活力影響較小。

2.6 重組氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性及動力學參數(shù)

氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性分析結(jié)果如表1所示。

表1 氨基甲酸乙酯水解酶的底物特異性Table 1 Substrate specificity of urethanase%

由表1可知，將UH對氨基甲酸乙酯的降解活性設為100%，可以看出酶對氨基甲酸酯類化合物以及酰胺類化合物均具有降解活性，對一些L-氨基酸類物質(zhì)以及尿素無降解活性，與Kazuo等[24]研究氨基甲酸乙酯水解酶對于氨基酸和尿素無降解活性的結(jié)果相符，UH對于2A級的致癌物丙烯酰胺同樣具有較高的水解活性，說明在降解丙烯酰胺方面具有良好的應用前景[28]。水解酶對于氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯的降解相對酶活分別為110.05%、7.02%，表明隨著底物碳原子數(shù)的增加，水解酶的水解能力逐漸降低[23]。

以氨基甲酸乙酯為底物，通過測定重組酶在不同底物濃度下的酶活，計算出初始反應速率，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖后計算得到UH的酶促反應參數(shù)Km值為6.64mmol/L，Vmax值為8.24μmol/min。與來源于肺炎克雷伯氏菌[23]和變幻青霉[29]的氨基甲酸乙酯水解酶的Km分別為74 mmol/L和27.2 mmol/L相比，本研究中UH的Km值相對更低，表明該酶與底物的親和力更大。

3 結(jié)論

根據(jù)大腸桿菌系統(tǒng)對密碼子的偏好性，將來源于Lodderomyces elongisporus菌屬的氨基甲酸乙酯水解酶的氨基酸序列進行密碼子優(yōu)化后合成其目的基因，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞中進行異源表達后得到分子量大小約為70 kDa左右的重組蛋白，將蛋白粗酶液進行超聲破碎后經(jīng)鎳柱進行純化后，水解酶的比活力達到了9.86 U/mg，是純化前的2.18倍。最適反應溫度為30℃，在最適反應溫度及以下，酶的穩(wěn)定性較好；最適pH值為7.0，在pH6.0～8.0時酶的活性以及穩(wěn)定性較好。UH對低質(zhì)量分數(shù)的NaCl溶液以及低體積分數(shù)的乙醇溶液具有一定耐受性，并且在乙醇體積分數(shù)低于12%時，酶活力可以保持在50%以上。不同種類的金屬離子對酶活均有不同程度的抑制作用，尤其是Cu2+、Fe3+存在的情況下，酶活力幾乎喪失。酶對氨基甲酸酯類化合物、酰胺類化合物有較強的降解能力，但是對于一些L-氨基酸類物質(zhì)以及尿素沒有活性，表明其屬于一種酰胺類的酶。以氨基甲酸乙酯作為反應底物時，氨基甲酸乙酯水解酶的酶促反應參數(shù)Km值為 6.64 mmol/L，Vmax值為 8.24 μmol/min。本研究通過對蛋白的目的基因進行合成后表達，驗證其具有氨基甲酸乙酯水解酶的活性，使UH的來源得到了豐富，同時為后續(xù)實際應用提供了很好的參考價值。