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    基于非靶向代謝組學(xué)的春閨與鐵觀音烏龍茶品質(zhì)研究

    2022-06-14 03:55:12余文權(quán)李鑫磊鐘秋生林鄭和單睿陽陳志輝陳常頌
    中國食品學(xué)報 2022年5期
    關(guān)鍵詞:毛茶鐵觀音烏龍茶

    余文權(quán),李鑫磊,鐘秋生,林鄭和,單睿陽,陳志輝,陳常頌

    (福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 福州 350012)

    烏龍茶是我國獨有的一種茶類,起源于福建,有閩北、閩南、廣東及臺灣四大產(chǎn)區(qū)。近年來烏龍茶產(chǎn)業(yè)得到迅猛地發(fā)展,深受國內(nèi)外消費者的喜愛。春閨【Camellia sinensis (L.) O.Kuntze】是從黃旦自然雜交后代中采用單株育種法育成的烏龍茶新品種(閩審茶2015001),屬灌木型,小葉類,晚生種。春閨生長勢較強,持嫩性較強,產(chǎn)量較高,抗性強。制烏龍茶,有特殊香氣且濃郁持久,味醇、湯中有香[1],區(qū)試點連續(xù)3年品質(zhì)高于對照黃旦[2]。代謝組學(xué)技術(shù)是一種高效多靶點地研究小分子物質(zhì)及其動態(tài)變化的技術(shù)[3]。代謝組學(xué)技術(shù)可分為靶向技術(shù)與非靶向技術(shù)。近年來,靶向與非靶向代謝組學(xué)技術(shù)聯(lián)合廣泛應(yīng)用于茶葉代謝物發(fā)現(xiàn)和動態(tài)變化研究[4-5]。目前,尚未有針對春閨品種制得的烏龍茶品質(zhì)特點的代謝組學(xué)研究。鐵觀音是閩南烏龍茶的最重要品種,成茶具有香高、持久等特點。本文采用春閨與鐵觀音鮮葉為原料,按照閩南烏龍茶工藝分別制成春閨與鐵觀音烏龍茶成茶。采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相飛行時間質(zhì)譜(HS-SPME/GC×GC-TOF-MS) 和超高效液相串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)分析春閨烏龍茶與鐵觀音烏龍茶之間揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物差異,探明春閨品種制作烏龍茶的成茶特征及其形成機理,為進(jìn)一步指導(dǎo)烏龍茶生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料與試劑

    春閨品種鮮葉 (CGX) 和鐵觀音品種鮮葉(TGYX)均于2017年5月采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福安市社口鎮(zhèn)茶園。液氮取樣,凍干,待測。按照閩南烏龍茶工藝將上述茶樹品種鮮葉分別制成春閨毛茶(CGM)和鐵觀音毛茶(TGYM),凍干、待測[6],每個處理均取3 份作為技術(shù)重復(fù)。

    色譜級乙腈、甲醇和甲酸,德國Merck 公司;無水乙醚,上海阿拉丁公司;表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(GC)、色氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、伽馬氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)、亮氨酸、天門冬氨酸、苯丙氨酸、腺苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和牡荊素,美國Sigma 公司;去離子水,美國Millipore 公司。

    1.2 試驗儀器與設(shè)備

    Pegasus 4D 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC×GC),美國LECO 公司;Agilent 7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS)、Infinity 1290 超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF-MS)、C18 色譜柱 【Zorbax Eclipse Plus(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)】,美國Agilent 公司;A11 多功能高速粉碎機,德國IKA 公司。

    1.3 樣品前處理

    1.3.1 揮發(fā)性組分 2018年3~5月,在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行樣品前處理。采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)提取烏龍茶樣品的香氣成分。具體操作步驟:精確稱取10 g 茶粉,加入15 μL 2 mg/mL 癸酸乙酯和100 mL 沸蒸餾水于450 r/min 條件下攪拌,放入烘箱中5 min,接著吸附40 min 后進(jìn)行GC×GC-TOF-MS 及GC-MS 檢測。每個樣品做3 個生物學(xué)重復(fù)。

    1.3.2 非揮發(fā)性組分 采用多功能高速粉碎機對上述茶樣進(jìn)行粉碎。稱取每個茶葉樣品0.3 g 于50 mL 離心管中,以45 mL 100 ℃蒸餾水浸提5 min,每隔1 min 對離心管上、下?lián)u晃,然后用高速離心機(轉(zhuǎn)速8 000 r/min)離心10 min,,取2 mL上清液,過0.22 μm 濾膜,基于UHPLC-Q-TOFMS 進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

    1.4 分析條件

    1.4.1 GC×GC-TOF-MS GC×GC 條件見表1。質(zhì)譜:EI;電離能量:-70 eV;質(zhì)量掃描范圍:33~600 m/z;離子源溫度:220 ℃。

    表1 全二維色譜條件Table 1 Experiment conditions of GC×GC

    1.4.2 UHPLC-Q-TOF-MS 流動相A 為0.1%甲酸-水,B 為甲醇;進(jìn)樣量2 μL。流速0.4 mL/min。柱溫40 ℃。采用梯度洗脫方式:0~3.5 min,使用10%流動相B;3.5~5.5 min,使用15%流動相B;5.5~7 min,使用32%流動相B;7~12 min,使用55%流動相B;12~15.5 min,使用75%流動相B;15.5~18 min,使用95%流動相B;18~18.1 min,使用10%流動相B;18.1~23 min,使用10%流動相B。質(zhì)譜:電噴霧離子化(ESI),掃描方式為正離子模式,毛細(xì)管電壓3 500 V,干燥氣溫度300 ℃,流速8 L/min,霧化氣壓強241 kPa,鞘氣溫度300℃,流速11 L/min,質(zhì)譜掃描范圍100~1 000 m/z。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 春閨和鐵觀音鮮葉及制成的閩南烏龍茶毛茶揮發(fā)性組分特征

    茶葉中揮發(fā)性組分含量雖低,但對茶葉品質(zhì)影響大,特別是烏龍茶。采用HS-SPME-GC×GCTOFMS 技術(shù)分析春閨和鐵觀音鮮葉以及制成的閩南烏龍茶毛茶的香氣組分,結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配、化合物保留時間、結(jié)構(gòu)譜圖及峰面積等方法共鑒定出572 種揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。對這些產(chǎn)物進(jìn)行主成分分析,如圖1所示:第1 主成分為53.9%,第2 主成分為18.5%,共計72.4%,包含樣本的大部分揮發(fā)物信息。春閨和鐵觀音鮮葉及相應(yīng)毛茶在揮發(fā)性組分方面表現(xiàn)出良好的分離度,鮮葉樣本均位于第1 主成分負(fù)軸,毛茶樣本均位于第1主成分正軸。

    圖1 春閨與鐵觀音揮發(fā)性組分主成分分析Fig.1 Principle component analysis plots of Chungui and Tieguanyin volatiles

    從主成分分析載荷圖(圖2)可以看出,根據(jù)坐標(biāo)位置推測春閨鮮葉中代表性組分為香葉醇、芳樟醇、苯乙醇、α-蒎烯等,鐵觀音鮮葉中的代表性組分為乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯、反式芳樟醇氧化物等。春閨和鐵觀音毛茶中的揮發(fā)性組分整體較接近,代表性物質(zhì)為十一烷、十烷、吲哚、β-羅勒烯、苯乙醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花叔醇、茉莉內(nèi)酯、脫氫芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-法尼烯等。

    圖2 春閨與鐵觀音揮發(fā)性組分載荷圖Fig.2 Loading plots of Chungui and Tieguanyin volatiles

    2.2 春閨和鐵觀音鮮葉及其毛茶主要揮發(fā)性組分相對含量的差異

    橙花叔醇、吲哚、法尼烯、β-羅勒烯、茉莉內(nèi)酯、脫氫芳樟醇等為烏龍茶重要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物,呈現(xiàn)特征花果香氣[7-11]。圖3顯示春閨和鐵觀音鮮葉及其毛茶之間主要揮發(fā)性組分相對含量的差異。春閨鮮葉中相對含量最高的揮發(fā)物為香葉醇(9.28%),香葉醇和α-蒎烯含量顯著高于鐵觀音鮮葉。鐵觀音鮮葉中相對含量最高的揮發(fā)物為乙酸葉醇酯(10.47%),鐵觀音鮮葉反式芳樟醇氧化物、脫氫芳樟醇和乙酸葉醇酯顯著高于春閨鮮葉。

    圖3 春閨和鐵觀音烏龍茶中主要揮發(fā)性組分差異Fig.3 Differences of important volatile components in CG and TGY oolong tea

    春閨毛茶中相對含量最高的化合物為吲哚(11.13%),吲哚在一定濃度條件下表現(xiàn)為茉莉花香,吲哚、茉莉內(nèi)酯、1-辛烯-3-醇、α-法尼烯、β-羅勒烯、己酸葉醇酯等顯著高于鐵觀音毛茶。鐵觀音毛茶中相對含量最高的化合物為吲哚(3.89%)和脫氫芳樟醇(3.84%),僅脫氫芳樟醇相對含量顯著高于春閨毛茶。春閨毛茶和鐵觀音毛茶中6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花叔醇和苯甲醛含量無顯著差異。

    2.3 春閨和鐵觀音鮮葉及制成的閩南烏龍茶毛茶非揮發(fā)性組分特征

    采用UHPLC-QTOF-MS 技術(shù)測定春閨和鐵觀音鮮葉及制成的閩南烏龍茶毛茶非揮發(fā)性代謝組分,共獲得2 897 個化合物信號,對上述組分進(jìn)行主成分分析。如圖4所示,第1 主成分為25.9%,第2 主成分為23.1%,共計49%,包含樣本一半左右的信息。樣品間表現(xiàn)出良好的分離度,從第1 主成分看,春閨鮮葉與毛茶均位于第1 主成分正軸,鐵觀音鮮葉與毛茶均位于第1 主成分負(fù)軸,說明第1 主成分體現(xiàn)不同品種間的差異物質(zhì);從第2主成分看,春閨與鐵觀音鮮葉位于第2 主成分正軸,春閨與鐵觀音毛茶位于第2 主成分負(fù)軸,說明第2 主成分體現(xiàn)加工前、后的差異物質(zhì)。對上述非揮發(fā)性代謝組分離子進(jìn)行差異化合物篩選 【P<0.05、變量投影重要性 (VIP)>1、倍數(shù)變化(Fold Change)>1.5】和鑒定,共鑒定出33 種差異代謝產(chǎn)物,見表2。兒茶素與兒茶素二聚體8 種,黃酮醇或黃酮糖苷7 種,游離氨基酸組分12 種,酚酸2種,香氣糖苷前體1 種,其它3 種。

    圖4 春閨與鐵觀音非揮發(fā)性組分主成分分析Fig.4 Principle component analysis plots of Chungui and Tieguanyin non-volatiles

    表2 春閨烏龍茶與鐵觀音烏龍茶非揮發(fā)性差異代謝物Table 2 Differential non-volatile metabolites identified in CG oolong tea and TGY oolong tea

    從圖5主成分分析載荷圖可看出,第1 主成分上,正軸分布全部黃酮醇或黃酮糖苷類組分、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、4-O-p-香豆酰奎寧酸和芳樟醇櫻草糖苷等為春閨品種代表性組分;負(fù)軸分布全部兒茶素與兒茶素二聚體、γ-氨基丁酸、谷氨酸、茶氨酸、茶氨酸葡萄糖苷、3-O-p-香豆??鼘幩帷⒙辄S素、茶沒食子素和茶堿等,為鐵觀音品種代表性組分。

    圖5 春閨與鐵觀音烏龍茶非揮發(fā)性組分載荷圖Fig.5 Loading plots of non-volatiles components of Chungui and Tieguanyin oolong tea

    2.4 春閨和鐵觀音鮮葉及其毛茶主要非揮發(fā)性組分相對含量差異分析

    兒茶素是茶葉中最主要的次級代謝產(chǎn)物,占茶樹鮮葉干重的12%~24%[12]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、ECG、表沒食子兒茶素(EGC)和EC 為茶葉中主要的兒茶素組分。圖6顯示,差異兒茶素組分為C、EC、ECG、EGC、GC 和EGCG,二聚兒茶素組分為原矢車菊素B1 和原矢車菊素B3。由于春閨品種鮮葉的EC、ECG 和原矢車菊素B1 相對含量均顯著低于鐵觀音鮮葉,因此其毛茶兒茶素組分均明顯低于鐵觀音品種。

    黃酮或黃酮醇糖苷類物質(zhì)與兒茶素組分含有相同的前體,包括槲皮素、山柰酚、楊梅素及其相應(yīng)糖苷。黃酮或黃酮醇糖苷類物質(zhì)占茶樹鮮葉的總酚類物質(zhì)最高達(dá)13%左右[14]。圖6顯示,差異黃酮或黃酮醇糖苷組分為山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖基蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基蕓香糖苷、芹菜素-6-阿拉伯糖-8-葡萄糖苷和芹菜素-6-葡萄糖-8-阿拉伯糖苷。黃酮或黃酮醇糖苷類物質(zhì)無論在鮮葉還是毛茶中,春閨品種均明顯高于鐵觀音品種。

    茶葉中富含多種氨基酸,目前,從茶葉中共鑒定出的氨基酸類型有26 種,其中20 種為蛋白質(zhì)氨基酸,6 種為非蛋白質(zhì)氨基酸[13]。氨基酸組分是茶湯鮮甜滋味的來源和部分香氣前體,圖6顯示,差異氨基酸組分為γ-氨基丁酸、谷氨酸、茶氨酸、茶氨酸葡萄糖苷、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸。春閨品種鮮葉中γ-氨基丁酸、谷氨酸和茶氨酸葡萄糖苷顯著高于鐵觀音品種,僅色氨酸顯著低于鐵觀音鮮葉。

    酚酸是一類含有酚環(huán)的有機酸。圖6顯示,差異酚酸組分為3-O-p-香豆??鼘幩岷?-O-p-香豆??鼘幩?。春閨烏龍茶酚酸組分相對含量均顯著低于鐵觀音烏龍茶。春閨品種鮮葉和毛茶中3-O-p-香豆酰奎寧酸顯著低于鐵觀音品種,4-O-p-香豆酰奎寧酸顯著高于鐵觀音品種。

    圖6顯示,麻黃素和芳樟醇櫻草糖苷在春閨與鐵觀音品種之間無顯著差異,春閨品種鮮葉和毛茶的茶沒食子素顯著低于鐵觀音品種,茶堿在鐵觀音鮮葉中明顯富集。

    圖6 從春閨與鐵觀音烏龍茶中鑒定出的物質(zhì)豐度熱圖Fig.6 Heat map of components abundance identified from Chungui and Tieguanyin oolong tea

    3 討論

    前人感官審評表明,用春閨品種制成的烏龍茶具有花香濃郁、持久的特點[1,6]。本研究發(fā)現(xiàn),春閨烏龍茶揮發(fā)性香氣組分整體與鐵觀音烏龍茶相近,且吲哚、橙花叔醇和茉莉內(nèi)酯等烏龍茶特征性組分顯著高于鐵觀音烏龍茶。吲哚是春閨烏龍茶相對含量最高的組分,由吲哚-3-磷酸甘油在色氨酸合成酶催化下形成,烏龍茶搖青工序引起色氨酸合成酶2 的β 亞基顯著表達(dá),吲哚積累,吲哚會進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為色氨酸與氧化吲哚[16]。本研究顯示,吲哚的次級代謝物色氨酸含量顯著低于鐵觀音品種,可能與春閨品種中控制吲哚轉(zhuǎn)化為色氨酸相應(yīng)酶類基因表達(dá)不高,引起吲哚大量積累有關(guān),結(jié)果還需進(jìn)一步驗證。另外,橙花叔醇和茉莉內(nèi)酯在機械力、低溫等多種脅迫條件下高表達(dá),由法呢基焦磷酸形成橙花叔醇[17],茉莉內(nèi)酯由α-亞麻酸與亞油酸在茶樹脂氧合酶1 作用下轉(zhuǎn)化而來[18],因在春閨品種中,上述揮發(fā)性組分前體或相應(yīng)基因的高表達(dá)而積累,其機理有待探究。

    春閨品種制成的烏龍茶具有滋味醇爽的特點[1]。本研究表明,與鐵觀音品種制成的烏龍茶相比,春閨品種鮮葉和毛茶中大部分兒茶素單體和二聚體低于鐵觀音品種,而黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)明顯富集,兒茶素組分與黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì)具有共同前體,因此,春閨品種中,前體可能更多地轉(zhuǎn)化為黃酮醇或黃酮糖苷類物質(zhì),使兒茶素組分含量降低。兒茶素組分在茶湯中表現(xiàn)為苦味,黃酮醇或黃酮糖苷的澀味閾值較低[19],表現(xiàn)為澀味,構(gòu)成春閨品種的醇爽滋味。

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