干酪乳酪桿菌Zhang的益生特性及其在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用研究

張和平，武 婷

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實驗室內(nèi)蒙古乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實驗室 呼和浩特 010018）

益生菌是指攝入足夠數(shù)量會對宿主健康產(chǎn)生有益作用的一類活的微生物的總稱，常見有乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，也包括其它細(xì)菌和真菌[1-2]。益生菌菌株的安全性評估應(yīng)基于全基因組測序生物信息分析，闡述待評價菌株所攜帶的耐藥基因、致病性基因和環(huán)境抗性基因的特征，結(jié)合體外微生物學(xué)檢測和體內(nèi)動物毒理學(xué)評價，以及人群和臨床試驗的安全評價等關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)，綜合判斷菌株的安全性。益生菌安全性和功能特性的探索和評價是一個長期、嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的過程，只有經(jīng)過充分科研驗證的益生菌劑量/組合才能實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[3]。本文以一株在科學(xué)循證和產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化方面均有深遠(yuǎn)影響力的干酪乳酪桿菌Zhang（Lacticaseibacillus casei Zhang，LCZ）為例，對其相關(guān)科學(xué)試驗展開論述。

1 LCZ 的分離、篩選與鑒定

LCZ 于2001年分離自內(nèi)蒙古錫林郭勒正藍(lán)旗大草原傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶（pH 3.37～3.94）[4]，具有良好的耐酸性及膽鹽耐受性[5-6]。在2008年完成了我國首株乳酸菌LCZ 的基因組測序[7-8]，標(biāo)志著國內(nèi)乳酸菌研究進(jìn)入基因組時代。此后，相繼對其進(jìn)行蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究，從基因?qū)用孀C明其不含有耐藥性和致病相關(guān)基因[9]，并運(yùn)用多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)深度解析該菌株耐酸、耐膽鹽等益生特性的相關(guān)機(jī)理[10-11]。LCZ 具有極高的遺傳穩(wěn)定性，在營養(yǎng)成分不足（碳源限制）[12-14]或抗生素（慶大霉素、阿莫西林）[15-16]脅迫的惡劣環(huán)境下，其細(xì)胞形態(tài)、活菌數(shù)、濁度等菌株生長表型特征以及耐藥表型、基因組均趨于穩(wěn)定。上述研究不僅佐證了該菌株具備食用安全性，更為深入探索其益生特性提供了必要條件。

2 基于動物模型實驗的LCZ 益生特性研究

疾病動物模型是開展基礎(chǔ)研究的有力手段，對疾病基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化均有重要意義。目前，本研究團(tuán)隊已完成LCZ 在免疫調(diào)節(jié)、炎癥與腫瘤、肝損傷和代謝類疾病等方面的動物模型研究，結(jié)果均表明該菌株具有顯著的益生作用。

2.1 免疫調(diào)節(jié)

益生菌能通過直接或間接調(diào)整宿主腸道微生物組成，激活宿主內(nèi)源性微生物群或者免疫系統(tǒng)的活性來實現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)功能。Wang 等[17]通過一項RAW264.7 巨噬細(xì)胞與LCZ 體外共培養(yǎng)試驗表明，LCZ 的活性菌體和滅活菌體均能通過增強(qiáng)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和Toll 樣受體的轉(zhuǎn)錄來改善巨噬細(xì)胞的先天免疫，證明該菌株具有作為抗病毒感染佐劑的潛力。在一項動物模型實驗中，50只雌性小鼠連續(xù)15 d 攝入LCZ 后引起廣泛的宿主免疫反應(yīng)，包括干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）及其受體基因轉(zhuǎn)錄的顯著增加，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的降低等[18]。LCZ 也能通過定植于腸道而增強(qiáng)上皮細(xì)胞間的緊密連接，調(diào)節(jié)免疫信號分子，進(jìn)而促進(jìn)免疫球蛋白A（sIgA）的分泌，誘導(dǎo)腸道黏膜反應(yīng)，結(jié)合釋放到血液中的細(xì)胞因子，共同作用于腸道，拮抗致病菌，增強(qiáng)免疫功能[19]。在此基礎(chǔ)上，LCZ 通過增強(qiáng)機(jī)體免疫效應(yīng)進(jìn)一步緩解和調(diào)節(jié)食物過敏癥狀[20-21]。

2.2 炎癥與腫瘤

癌癥是我國近年來發(fā)病率上升最快的腫瘤之一，炎癥可促進(jìn)早期腫瘤發(fā)展為成熟癌癥。LCZ 可提高氯離子運(yùn)輸調(diào)節(jié)因子（CFTR）的表達(dá)，下調(diào)初級炎癥信號因子磷酸化細(xì)胞信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（p-STAT3）或蛋白激酶B/核因子κB（Akt/NF-κB）等的表達(dá)，進(jìn)而提高結(jié)腸組織學(xué)評分，降低宿主炎癥因子，調(diào)節(jié)腸道菌群，緩解雷帕霉素誘導(dǎo)的腸黏膜損傷，預(yù)防小鼠結(jié)腸炎。同時，LCZ 能夠顯著提升有益微生物及其代謝產(chǎn)物含量，促進(jìn)盲腸丁酸和乙酸的分泌，顯著提升血清脂聯(lián)素和骨鈣素水平（P<0.05），預(yù)防小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[22]。有研究證實，腸道菌群失衡易導(dǎo)致乳腺炎，使用LCZ 進(jìn)行干預(yù)可以恢復(fù)腸道菌群功能并緩解乳腺炎癥，對益生菌用于治療人體乳腺炎具有一定的參考和借鑒意義[23]。在LCZ 的干預(yù)下，NF-κB 和絲氨酸/蘇氨酸激酶（GSK-3β）參與慢性炎癥、細(xì)胞增殖和脂聯(lián)素調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加，結(jié)腸組織中相關(guān)蛋白表達(dá)同樣明顯升高，降低了結(jié)腸癌變的易感性，腫瘤數(shù)量和體積顯著降低（P<0.05），可有效抑制腫瘤惡變[24]。

2.3 肝損傷

腸道微生態(tài)失衡與肝損傷病程發(fā)展密切相關(guān)，益生菌制劑能通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的方式緩解或治療肝損傷。Wang 等[25]利用40 只雄性大鼠探究LCZ 降低肝臟炎癥，緩解大鼠急性肝損傷的作用效果和機(jī)制。持續(xù)干預(yù)30 d 后發(fā)現(xiàn)，LCZ 可降低脂多糖和D-半乳糖胺導(dǎo)致的毒素、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β 和一氧化氮的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化，誘導(dǎo)Toll 樣受體2（TLR2）、Toll 樣受體9（TLR9）和過氧化酶活化增生受體γ 抗體（PPARγ）的表達(dá)，調(diào)控腸道菌群，減輕肝臟炎癥。類似地，Wang 等[26]和張曉慧等[27]的相關(guān)試驗同樣證明，LCZ 對藥物誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用，作用機(jī)制與其抗氧化和抗炎活性有關(guān)。

2.4 代謝疾病

益生菌在高脂血癥和糖尿病等代謝性疾病的治療中同樣顯示出良好的效果，可作為該類疾病的輔助治療手段。LCZ 通過調(diào)節(jié)肝臟中參與脂肪酸β-氧化基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪分解代謝，可以顯著降低高膽固醇血癥大鼠血清和肝臟中的膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平，血清甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇分別降低31.5%和30.8%[28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)LCZ 有助于降低肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，減輕氧化應(yīng)激，顯著提高總抗氧化能力，促使一些抗氧化指標(biāo)恢復(fù)到正常水平，進(jìn)而緩解血液和肝臟脂質(zhì)過氧化[29]。

LCZ 通過胰高血糖素樣肽-2（GLP-2）機(jī)制減少果糖吸收并維持低水平胰島素，通過脆弱擬桿菌介導(dǎo)的維生素K2 依賴性骨鈣素機(jī)制改善口服葡萄糖耐量[22]。在對糖尿病的治療效果上表現(xiàn)為，盲腸菌群中膽汁酸7α 羧化菌降低以及糞便膽汁酸組成變化與器官組織氯離子的內(nèi)流相一致，通過調(diào)節(jié)菌群相關(guān)的膽汁酸與氯離子交換來有效預(yù)防大鼠Ⅱ型糖尿病[30]。

2.5 其它研究

大鼠的行為學(xué)測試結(jié)果表明LCZ 的攝入對于大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力具有顯著的提升作用[31]。LCZ 能調(diào)節(jié)因鐵含量攝入異常（低鐵飲食或高鐵飲食）而引起的腸道菌群失衡。一方面，LCZ 能促進(jìn)低鐵飲食小鼠（8 周干預(yù)）腸道菌群恢復(fù)和代謝穩(wěn)態(tài)（L-組氨酸和黃素的生物合成途徑），顯著降低促炎因子IL-18 水平，增加小鼠對炎癥的抵抗作用，緩解炎癥反應(yīng)[32]。另一方面，LCZ 對于高鐵飲食誘導(dǎo)的菌群及血清鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)同樣具有顯著的調(diào)控作用（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。綜上，模型動物的功能驗證為LCZ 在臨床/人群試驗的開展提供了充分的依據(jù)。

3 基于臨床/人群試驗的LCZ 益生特性研究

人體腸道菌群的變化錯綜復(fù)雜，益生菌、營養(yǎng)成分和藥物等與腸道菌群的相互作用關(guān)系更是如此。運(yùn)用臨床/人群試驗研究人體腸道菌群變化及其作用機(jī)制是最直接、有效的方法。本研究團(tuán)隊圍繞LCZ 對宿主的健康影響開展了大量的臨床/人群試驗，用以表征該菌株作用于人體的益生效果及其健康機(jī)制。

3.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

益生菌可直接改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和調(diào)控菌群代謝網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而對相關(guān)疾病治療提供幫助。LCZ 對于人體腸道菌群及其代謝具有顯著的調(diào)控作用，可以顯著提高腸道菌群多樣性和糞便中短鏈脂肪酸含量。24 名不同年齡段成年人（青年均齡24.3歲，中年均齡47.6 歲，老年均齡64.7 歲）連續(xù)28 d攝入LCZ 后，腸道中有害菌數(shù)量有所降低，且腸道菌群的豐度和多樣性顯著提高（P<0.001）；糞便短鏈脂肪酸持續(xù)升高，總膽汁酸持續(xù)降低[33-34]。LCZ 還可以通過提高腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，降低腸道年齡指數(shù)，促使老年人腸道菌群年輕化[35]。

另外，攝入LCZ 可以顯著增加腸道中有益菌的含量，部分受試者從糞便普雷沃氏菌/普氏棲糞桿菌腸型（PF）轉(zhuǎn)化為普氏棲糞桿菌/多氏擬桿菌腸型（FB），脂多糖的生物合成能力降低，腸道磷酸鹽代謝模塊、氨基酸運(yùn)輸系統(tǒng)和異亮氨酸的生物合成得以增強(qiáng)[36-37]。

3.2 上呼吸道疾病

不同的生活模式和環(huán)境因素會引起呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化，益生菌的健康作用還體現(xiàn)在呼吸道疾病中的改善作用。LCZ 可通過免疫激活、抗氧化和抗炎作用對上呼吸道感染和紅細(xì)胞異常進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以顯著縮短鼻、咽、流感和全呼吸系統(tǒng)疾病癥狀的持續(xù)時間（P<0.05），改善血紅蛋白濃度（MCHC）和紅細(xì)胞沉降率（ESR），緩解老年人紅細(xì)胞異常導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕上呼吸道感染癥狀[38]。

3.3 急慢性腎臟病

一項LCZ 緩解急慢性腎臟病的臨床試驗研究表明，攝入LCZ 能夠增加腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸有益菌的豐度，改善腸道炎癥和腸黏膜屏障損傷，減輕急性腎臟損傷及其纖維化；還能有效降低人體血清胱抑素C 水平，抑制血清甲狀旁腺激素和尿白蛋白肌酐比（UACR）增長，延緩因服用藥物導(dǎo)致的煙酰胺含量下降，減緩患者慢性腎病的發(fā)展和腎功能的下降[39]。

4 益生菌LCZ 在發(fā)酵乳中應(yīng)用研究

發(fā)酵乳是將益生菌傳遞到人體胃腸道的理想載體，是益生菌在功能性食品領(lǐng)域的重要應(yīng)用形式。將益生菌LCZ 應(yīng)用于牛乳、馬乳和豆乳等基質(zhì)中，均能提升發(fā)酵速率，且發(fā)酵乳后酸化程度較弱[40]，具有潛在的應(yīng)用價值和重要的理論意義。

4.1 不同載體中生長機(jī)制

豆乳和牛乳作為LCZ 的良好載體，可以顯著提高菌體胃腸消化液耐受能力，有助于發(fā)揮其益生功效。為解析LCZ 在不同基質(zhì)（豆乳/牛乳）中生長的分子機(jī)理，Wang 等[41]利用全基因組芯片技術(shù)對其發(fā)酵過程轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)進(jìn)行比較分析。通過蛋白組學(xué)分析鑒定出104 個差異表達(dá)點(diǎn)，主要與碳水化合物、核苷酸和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)。其中，L-谷氨酰胺能通過促進(jìn)嘌呤、嘧啶和氨基糖代謝，從而在豆乳和牛乳中起到促進(jìn)菌株生長作用。豆乳發(fā)酵過程中的特異轉(zhuǎn)錄變化揭示了一些促進(jìn)LCZ 生長的因子，如低聚肽、氨基酸和Mn2+[42]。LCZ 在牛乳發(fā)酵后期通過編碼碳水化合物代謝和能量產(chǎn)生、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和分子伴侶基因，調(diào)節(jié)其生長和存活[43]。以上研究表明，LCZ 在牛乳和豆乳中發(fā)酵的一些有利的代謝途徑，對于提高其菌體生物量及工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵制品具有重要意義。

4.2 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)屬性

質(zhì)構(gòu)是發(fā)酵乳產(chǎn)品的骨架，優(yōu)良的發(fā)酵菌種與合理的生產(chǎn)工藝相結(jié)合可產(chǎn)生理想的質(zhì)構(gòu)屬性。LCZ 參與發(fā)酵可導(dǎo)致產(chǎn)品的高彈性因子（EI）和低固液平衡值（SLB）的流變學(xué)特性，且發(fā)酵乳的黏聚力（Cohesiveness）、黏度指數(shù)（Viscosity index）、黏度和胞外多糖（EPS）含量均顯著高于對照組。由此，添加LCZ 可以促進(jìn)發(fā)酵乳形成高彈性、偏固態(tài)的凝膠結(jié)構(gòu)，促使發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)更穩(wěn)定，產(chǎn)品黏稠度增加，乳清析出減少，從而賦予發(fā)酵乳產(chǎn)品獨(dú)特的質(zhì)地與口感[44-45]。

4.3 發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)

菌株是影響發(fā)酵乳產(chǎn)品風(fēng)味的主要因素，將LCZ 應(yīng)用于發(fā)酵乳，可提高產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)。LCZ 與商業(yè)發(fā)酵劑復(fù)合發(fā)酵制備攪拌型發(fā)酵乳，使得發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量增加了17.1%，有助于提升發(fā)酵乳的整體感官品質(zhì)[46]。LCZ 與嗜熱鏈球菌復(fù)配可賦予發(fā)酵乳更細(xì)膩的質(zhì)感、更濃郁的奶油和乙醛風(fēng)味，同樣提升了發(fā)酵乳的整體風(fēng)味特征[47]。發(fā)酵乳中，LCZ 能促進(jìn)動物雙歧桿菌乳亞種V9 和動物雙歧桿菌乳亞種Probio-M8 生長，同時有利于揮發(fā)性代謝產(chǎn)物（乙醛、雙乙酰、乙偶姻和乙酸）、非揮發(fā)性成分（半乳糖、氨基糖和核苷酸糖、果糖和甘露糖等）的積累[48-49]。以上研究表明，LCZ 具有優(yōu)良的發(fā)酵特性和貯藏穩(wěn)定性，可作為益生菌發(fā)酵乳的優(yōu)良菌株，顯著提升其感官屬性和營養(yǎng)價值。其與基礎(chǔ)發(fā)酵劑復(fù)配發(fā)酵，有助于開發(fā)出具有高益生菌活力和獨(dú)特代謝譜的益生菌發(fā)酵乳。

5 展望

益生菌對腸道菌群的影響以及腸道菌群和疾病關(guān)系已成為國際科學(xué)研究的熱點(diǎn)。經(jīng)科學(xué)驗證的LCZ 被充分證明具有改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌豐度，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及預(yù)防/治療諸多疾病的有益健康功效。未來，應(yīng)在食品、護(hù)膚、美妝、醫(yī)藥、保健品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)和生物藥等領(lǐng)域繼續(xù)探索，深入挖掘其益生功能和價值屬性，助力益生菌產(chǎn)業(yè)的多元化發(fā)展。