發(fā)酵香腸制作過程中菌群演替及揮發(fā)性風味成分變化規(guī)律

張香美，葉 翠，盧 涵，裴正鈺，閆洪波

（河北經貿大學生物科學與工程學院 石家莊 050061）

發(fā)酵香腸是經微生物發(fā)酵而成的具有典型發(fā)酵香味的肉制品。微生物菌群的變化是影響發(fā)酵香腸品質的關鍵。研究發(fā)酵過程微生物菌群結構、相對豐度的變化和揮發(fā)性香氣成分的變化規(guī)律，對于發(fā)酵香腸制品質量的穩(wěn)定和品質的提升具有重要意義。Lin 等[1]用高通量測序和GC-TOF-MS、UPLC-QTOF-MS 分析老撾火腿不同成熟階段微生物群落和代謝產物之間的關系。高通量測序技術可較為準確地分析樣品中不同分類水平的微生物的組成[2]、相對豐度等信息[3-4]。氣相色譜-離子遷移譜技術（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS） 是近年出現(xiàn)的一種新興的風味物質分析手段，可用于食品特征風味有機揮發(fā)組分的快速檢測、識別。Liu 等[5]用該方法分析了特定老化時間金華火腿的特征香氣成分。Tian 等[6]用電子舌和頂空-GC-IMS 分析不同鹽含量的干腌豬肉的風味成分，均呈現(xiàn)出非常好的區(qū)分度。

本研究旨在通過高通量測序技術研究植物乳桿菌-腐生葡萄球菌雙菌種發(fā)酵香腸制作過程中微生物菌相的演替規(guī)律，用GC-IMS 檢測不同階段發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味成分，建立發(fā)酵香腸制作過程中菌群和揮發(fā)性風味成分的關系，為生產高質量發(fā)酵香腸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬肉購于石家莊市北國超市；植物乳桿菌b-2（CGMCC No.13413）和腐生葡萄球菌sw50由河北經貿大學益生菌實驗室分離并保存。

E.Z.N.A.?soil 試劑盒，美國Omega Bio-tek公司。

Flavour-Spec?氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀，德國G.A.S.公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵劑的制備 分別吸取活化好的植物乳桿菌b-2 和腐生葡萄球菌sw50 接種到MRS 和LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/min，4℃離心10 min 收集菌體，洗滌2～3 次，用無菌生理鹽水重懸制備菌懸液，調整菌體密度為109CFU/mL。

1.2.2 發(fā)酵香腸的制備 將新鮮豬肉用絞肉機絞碎，按照肥瘦比為1∶4（質量比）進行混合，加入食鹽2.5%，白糖2.5%，發(fā)色劑0.2%，充分混勻。將活化好的植物乳桿菌b2 和腐生葡萄球菌sw50 按107CFU/g 肉的比例接種，其中兩菌接種比例為1∶3，灌入腸衣內，置于培養(yǎng)箱37 ℃發(fā)酵30 h。

1.2.3 菌群高通量測序分析 采用E.Z.N.A.?soil試劑盒提取不同發(fā)酵時間香腸樣品的總DNA。DNA 純度 （A260nm/A280nm、A260nm/A230nm） 及濃度采用NanoDrop 2000 進行檢測。樣本送深圳微生態(tài)科技有限公司，采用338F-806R 為引物對V3～V4 區(qū)進行PCR 擴增，根據(jù)Illumina MiSeq 平臺（Illumina，圣地亞哥，美國）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2*300 的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序，每組設5 個重復。

測序結束后，運用QIIME2 feature-classifier插件將ASV 的代表序列比對到99%相似度的GREENGENES 數(shù)據(jù)庫，得到物種分類信息表[7]。

1.2.4 揮發(fā)性風味物質的測定 分別對不同發(fā)酵時間（0，6，12，18，24，30 h）的發(fā)酵香腸進行采樣，保存于-70 ℃。揮發(fā)性風味物質的測定采用FlavourSpecR氣相離子遷移譜聯(lián)用儀。取2 g 樣品于20 mL 頂空進樣瓶中，自動進樣器參數(shù)設置為：頂空瓶孵化溫度40 ℃，孵化時間15 min，孵化速度500 r/min，進樣針溫度85 ℃，進樣體積500 μL，每個樣品設3 個重復。

氣相色譜相關參數(shù)為：色譜柱FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm），色譜柱溫度：60 ℃，載氣：N2，運行時間：30 min，載氣起始流速2 mL/min，保持2 min，2～10 min 增至10 mL/min，10～20 min 增至100 mL/min，20～30 min 增至150 mL/min。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 高通量測序試驗數(shù)據(jù)均采用平均值，用GraphPad Prism 8.02 作圖。采用GCIMS Library Search 軟件對揮發(fā)性風味物質進行定性分析。運用Laboratory Analytical Viewer（LAV） 分析軟件中Reporter 和Gallery Plot 插件構建揮發(fā)性風味物質的指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵香腸生產過程中微生物群落結構分析

為了研究發(fā)酵香腸樣品物種組成，對所有樣品的全部的有效序列進行聚類/去噪，形成操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU），也稱特征序列。選取OTU 的代表性序列，與核糖體RNA 數(shù)據(jù)庫（Greengenes database 13_8）進行比對獲得物種注釋信息。根據(jù)OTU 劃分和分類地位鑒定結果，從屬水平分析不同階段發(fā)酵香腸中微生物種群的結構，可以獲得不同發(fā)酵香腸樣本在屬水平的具體微生物組成及豐度，結果見圖1和2。

圖1 優(yōu)勢菌屬在不同發(fā)酵階段樣品中的相對豐度Fig.1 Relative abundance of dominant bacteria in samples at different fermentation stages

如圖1所示為注釋到屬水平的序列數(shù)目占總注釋數(shù)據(jù)的比率。通過對細菌群落中主要優(yōu)勢菌屬（前20 位）進行分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵香腸成熟過程中，不同階段的菌群結構存在一定差異。在各發(fā)酵階段，乳桿菌科（Lactobacillaceae）細菌均占據(jù)絕對優(yōu)勢，其相對豐度為61.50%～92.81%；其次是葡萄球菌屬（Staphylococcus），相對豐度為3.22%～26.83%；再次是短桿菌屬（Brevibacterium），相對豐度為1.76%～7.62%，這與對發(fā)酵香腸樣品中的乳酸菌和葡萄球菌活菌數(shù)測定結果一致。Quijada等[8]對干發(fā)酵香腸的微生物群落的研究也發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬占主導，為65.1%～92.0%。16S rDNA V3～V4 菌群高通量測序可以對微生物的多樣性和種群分類進行分析，反映菌群的特征信息，然而由于測序長度僅400 bp，故具有一定的局限性。

通過對不同發(fā)酵階段優(yōu)勢菌屬豐度進行比較可以看出，乳桿菌科細菌在30 h 時占比最高，達92.81%；葡萄球菌屬細菌在12 h 相對豐度增至最高，為26.83%，然后逐漸下降；短桿菌屬細菌在初始階段豐度最高，為7.62%，然后呈先下降后上升又下降趨勢。

如圖2所示，熱圖可直觀地反應微生物的相對豐度變化情況，顏色越深，說明在屬水平上的微生物比其它樣品中的相對豐度更高。從圖2可以看出，在0 h，源于發(fā)酵菌種的接入，乳桿菌科和葡萄球菌屬占優(yōu)勢。在發(fā)酵初期，相對豐度高的除了乳桿菌科和葡萄球菌屬外，還有短桿菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）。環(huán)絲菌屬和假單胞菌屬均是生鮮肉類中常見的腐敗菌[9]，假單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬均與冷鮮豬肉的腐敗有關[10]。隨著發(fā)酵過程中菌群演替的推進，乳桿菌科細菌相對豐度逐漸上升，發(fā)光桿菌屬和環(huán)絲菌屬相對豐度逐漸下降，說明發(fā)酵菌種的接入抑制了腐敗菌，進而保障了發(fā)酵香腸的品質。

圖2 不同發(fā)酵階段樣品中微生物屬分類水平熱圖Fig.2 Heat map of genus classification level of microorganisms in samples at different fermentation stages

2.2 不同發(fā)酵階段香腸揮發(fā)性香氣成分組成變化分析

2.2.1 不同發(fā)酵階段香腸整體揮發(fā)性風味物質分析 GC-IMS 為揮發(fā)性香氣成分提供了可視化結果。不同發(fā)酵階段香腸香氣成分離子遷移譜圖如圖3所示，縱坐標為氣相保留時間，橫坐標為離子遷移時間，橫坐標1.0 處紅色豎線為反應離子峰（Reaction ion peak，RIP）；RIP 峰兩側的每一個點代表一種揮發(fā)性有機化合物。顏色表示物質的濃度，顏色越深、面積越大表示含量越大[11]。不同發(fā)酵階段香腸樣品中的揮發(fā)性風味化合物的差異主要表現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量、強度及時間上。從圖3中可得出：6 個不同發(fā)酵時間香腸中的揮發(fā)性組分可通過GC-IMS 技術很好地分離，不同發(fā)酵階段香腸具有各自不同的GC-IMS 特征譜信息。各發(fā)酵階段香腸揮發(fā)性風味化合物含量及種類都有較大差異。在發(fā)酵過程中，伴隨著菌相變化以及各成分之間的生物化學反應，部分揮發(fā)性香氣成分的濃度增加，并且還產生了一些新的物質。

圖3 不同發(fā)酵階段香腸氣相色譜-離子遷移譜圖Fig.3 Gas chromatography-ion migration spectra of sausage at different fermentation stages

2.2.2 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質定性分析 對揮發(fā)性香成分的定性分析結果表1所示，在發(fā)酵香腸中識別出了27 種揮發(fā)性有機物，包括9 種醛類、5 種酯類、5 種醇類、4 種酮類、2 種酸類、1 種烷烴類和1 種吡嗪類。醛類主要來源于脂肪氧化，具有較低的閾值，是發(fā)酵香腸中重要的揮發(fā)性風味化合物，它還可進一步與其它化合物反應生成調味物質[12]。樣品中鑒定出的醛類物質主要有：3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、戊醛、乙縮醛、己醛、糠醛、辛醛。其中，3-甲基丁醛和2-甲基丁醛是高香味活性值的風味物質，3-甲基丁醛呈巧克力、麥芽香，與含硫化合物反應時可生成一種類似培根的風味[13]，是香腸風味的主要貢獻者之一，2-甲基丁醛具有黃油、焦糖風味[14]。戊醛和辛醛分別具有脂香、鮮草香味[15]，糠醛呈甜香、木香、焦糖香[16]，而己醛具有生的油脂和青草氣及蘋果香味[17]。Shi 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，己醛、3-甲基-丁醛和辛醛也是大河烏豬干腌火腿的特征化合物。乙縮醛是一種重要的揮發(fā)性風味化合物，在發(fā)酵藍莓酒[19]和食用花朵[20]中均有檢出，然而其風味還有待進一步確認。

表1 發(fā)酵香腸樣品揮發(fā)性物質定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile substances in fermented sausage samples

酯類物質是由于酸和醇通過酯化作用所形成的，對發(fā)酵香腸香氣的形成具有重要作用，樣品中檢出了3-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、γ-丁內脂和乙酸正丙酯，其中乙酸乙酯具有醚香、果香氣味，且呈味閾值低[21]；3-甲基丁酸乙酯呈甜香、脂香味，周慧敏等[22]在添加了葡萄球菌的臘肉中檢測到了該種物質；γ-丁內酯具有牛奶、奶油的氣味，趙冰等[23]在特級金華火腿中檢測到了該類揮發(fā)性風味物質。

醇類主要賦予食品植物香味和芳香味，發(fā)酵香腸中的醇類物質主要來源于脂質降解，通常不飽和脂肪醇閾值較低，對風味具有潛在促進作用[24]，其它醇類物質風味閾值較高，對整體風味影響較小。如圖3和表1所示，樣品中檢出了乙醇、1-辛烯-3-醇、正己醇和異戊醇等。1-辛烯-3-醇來源于脂質氧化，具有蘑菇味，且氣味閾值較低，是發(fā)酵香腸中的重要風味物質[25]。

酮類物質在發(fā)酵肉制品中起到增強風味的作用，主要來源于β-酮酸脫羧或游離脂肪酸的不完全β 氧化和氨基酸類物質的降解。2-丁酮是多種發(fā)酵肉中的主要風味物質[26-27]。2-丁酮、2-庚酮具有香蕉、奶酪及輕微的藥香[28]。

酸類物質可以提高產品的風味復雜性，促進發(fā)酵香腸形成其獨有的感官風味特點。樣品中檢測出了丁酸和異戊酸。丁酸是一種重要的風味物質，曹辰辰等[15]的研究結果表明，接種植物乳桿菌CD101 和模仿葡萄球菌NJ201 組的丁酸含量顯著高于對照組和接種商業(yè)發(fā)酵劑組。

吡嗪類化合物主要呈現(xiàn)豆豉、堅果風味[29]，被認為是許多食品中的關鍵風味成分。本樣品中檢測出了三甲基吡嗪，該雜環(huán)化合物通常會產生令人愉悅的烤肉味、堅果味、烤玉米味等香氣氣味[30]。

由于烷烴類閾值很高，對改善風味作用甚微，故未列入主要揮發(fā)性風味物質。

2.2.3 發(fā)酵香腸不同階段揮發(fā)性物質GC-IMS 指紋圖譜分析 為比較不同階段發(fā)酵香腸之間揮發(fā)性風味化合物的差異，用GC-IMS 二維圖譜中所有譜峰重構指紋圖譜，以識別不同階段發(fā)酵香腸的特征峰區(qū)域[31]和香腸發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣成分的變化規(guī)律。

圖4是不同階段發(fā)酵香腸中揮發(fā)性風味化合物的指紋譜圖，每一行代表香腸樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機物在不同樣品中的信號峰。由指紋圖譜可知：揮發(fā)性化合物會隨著發(fā)酵進程而變化。隨著發(fā)酵時間的延長，香腸中大部分揮發(fā)性物質的濃度逐漸增高，如乙縮醛、乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁酸、異戊酸、乙醇、己醇、己醛、戊醛、丙酮、2-丁酮、2-庚酮、三甲基吡嗪、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等，這種濃度增高的趨勢在前4 個階段變化比較快，隨后變化放緩；小部分揮發(fā)性物質在發(fā)酵過程中濃度降低，如乙酸正丙酯、糠醛、γ-丁內酯等物質。

圖4 不同發(fā)酵階段香腸樣品揮發(fā)性物質指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of volatile substances in sausage samples at different fermentation stages

在初始階段，揮發(fā)性香氣成分主要是乙酸正丙酯、糠醛、γ-丁內酯以及呋喃酮。發(fā)酵6 h，乙縮醛單體、丙酮、乙縮醛二聚體、2-庚酮以及3-甲基丁醛、2-甲基丁醛逐漸增多；丁酸、乙醇在發(fā)酵12 h 顯著增多；經過18 h 發(fā)酵，乙酸乙酯、異戊酸、3-甲基丁酸乙酯逐漸生成；發(fā)酵24 h，3-甲基丁酸乙酯二聚體、正己醇逐漸生成；發(fā)酵結束階段，1-辛烯-3-醇、異戊醇、丙酮、三甲基吡嗪、乙酸乙酯、異戊酸、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛成為主體。在發(fā)酵的前期，以醛、酮等的合成為主，發(fā)酵中期酯類物質逐漸增多，1-辛烯-3-醇、三甲基吡嗪在后期達到高峰。酯類化合物是發(fā)酵香腸中重要的揮發(fā)性化合物，主要來源于微生物酯酶催化的短鏈酸與醇的酯化反應[32]，在發(fā)酵后期合成。本發(fā)酵香腸中的酯類物質在發(fā)酵18 h 開始形成，在發(fā)酵結束時達到高峰。

由于GC-IMS 技術起步較晚，標準的揮發(fā)性有機物數(shù)據(jù)庫不完善，本批樣品中17 種重要揮發(fā)性風味成分未能很好地解析。

2.3 不同階段發(fā)酵香腸菌群結構與揮發(fā)性香氣成分的關系

采用Pearson 相關性分析法對微生物菌群數(shù)據(jù)和關鍵風味物質的相關性進行深度分析和挖掘，分別找到與關鍵揮發(fā)性風味物質高度相關的微生物種類，為解析發(fā)酵香腸制作過程中的功能微生物提供數(shù)據(jù)支持，如圖5所示。

圖5 屬水平優(yōu)勢菌群與揮發(fā)性香氣成分相關關系分析熱圖Fig.5 Heat map of correlation analysis between dominant flora at genus level and volatile flavor components

乳桿菌科、乳桿菌屬、厭氧球菌屬與辛醛、異戊醇、己醛的合成呈正相關。乳桿菌科、乳桿菌屬、厭氧球菌屬（Anaerococcus）和肉食桿菌屬（Carnobacterium） 與1-辛烯-3-醇的合成呈正相關。Lü 等[33]的研究也發(fā)現(xiàn)酸肉中的己醛、1-辛烯-3-醇、辛醛是由乳桿菌屬產生的主要揮發(fā)性化合物。乳桿菌科細菌、乳桿菌屬、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、厭氧球菌屬與三甲基吡嗪、2-丁酮、丁酸、乙酸乙酯、異戊酸、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯二聚體的合成呈正相關?？梢?，乳桿菌科細菌與1-辛烯-3-醇、三甲基吡嗪、乙酸乙酯以及己醛、辛醛和2-丁酮等風味物質的合成密切相關，劉英麗等[14]也有類似的報道。

葡萄球菌屬、短桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、嗜冷桿菌屬 （Psychrobacter）、環(huán)絲菌屬、不動細菌屬（Acinetobacter）、巨球菌屬（Macrococcus）與乙酸正丙酯、糠醛、γ-丁內酯、呋喃酮的生成呈正相關。葡萄球菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）與2-甲基丁醛、3-甲基丁醛的合成呈正相關。于倩倩等[12]的研究也表明葡萄球菌產生大量支鏈醛。

葡萄球菌屬與乙酸乙酯、三甲基吡嗪、丙酮等的合成呈負相關。乳桿菌科與乙酸正丙酯、糠醛、γ-丁內酯、呋喃酮的生成呈負相關。乳桿菌屬與2-甲基丁醛、3-甲基丁醛的合成呈負相關。菌群的演替對揮發(fā)性香氣成分的形成具有重要的影響，維持菌群結構的穩(wěn)定對于高品質發(fā)酵香腸的生產具有重要的意義。

3 結論

為研究香腸發(fā)酵過程中菌群與揮發(fā)性風味成分的相關關系，采用高通量測序與GC-IMS 對不同發(fā)酵階段的香腸進行菌群結構和揮發(fā)性香氣成分聯(lián)合分析。結果表明：在發(fā)酵過程中，乳酸菌科細菌始終占據(jù)絕對優(yōu)勢，其次是葡萄球菌屬、短桿菌屬。乳桿菌科細菌與1-辛烯-3-醇、三甲基吡嗪、乙酸乙酯以及己醛、辛醛和2-丁酮等揮發(fā)性風味物質的合成正相關，葡萄球菌屬與2-甲基丁醛、3-甲基丁醛的合成呈正相關。在發(fā)酵初期，以醛、酮為主，發(fā)酵中期酯類物質逐漸增多，1-辛烯-3-醇、三甲基吡嗪在后期達到高峰。高通量測序得到的信息更接近于樣品微生態(tài)，能夠全面解析發(fā)酵香腸制作過程中的菌群演替，GC-IMS 可以用于發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味的可視化檢測，對不同發(fā)酵階段產生的揮發(fā)性組分可以很好地進行區(qū)分。利用高通量測序和GC-IMS 闡明發(fā)酵香腸中的揮發(fā)性香氣成分與菌群變化的相關關系，可以為生產高品質發(fā)酵香腸提供科學支撐，對進一步提高和改善發(fā)酵香腸品質具有重要的意義。本研究未對發(fā)酵香腸中的非揮發(fā)性香氣成分進行測定，應進一步開展相關研究，從而更準確、更全面地分析風味化合物，助推發(fā)酵香腸品質提升。