枇杷花多酚納米顆粒的制備工藝及其特性研究

謝子玉，薛 琛，文祖會(huì)，趙雯靚，徐麗珊，2*

（1 浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 浙江金華 321004 2 浙江省特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江金華 321004）

枇杷花為薔薇科枇杷屬植物枇杷【Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl】的花，富含萜類、多酚類和揮發(fā)油等成分[1]，可藥食兩用。多酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)的次生代謝物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗菌等生物活性[2-5]，在食品添加劑、保健和醫(yī)藥等行業(yè)具有較大開發(fā)潛力。然而，多酚類物質(zhì)對環(huán)境敏感度高，在高溫、光照、氧氣等條件下易失活[6]，限制了其應(yīng)用。

許多研究者發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-多糖靜電復(fù)合物經(jīng)高于蛋白質(zhì)變性的溫度處理后能進(jìn)一步暴露疏水基團(tuán)，所形成的蛋白-多糖顆粒通過疏水、氫鍵等弱相互作用對多酚類物質(zhì)進(jìn)行包載[7-9]，從而有效提高多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性和生物利用度。Li 等[10]通過熱處理制得的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）-BSA-ι-卡拉膠納米顆粒，對EGCG 的包埋率為78%，與未經(jīng)熱處理的天然BSA 和純BSA體系相比，BSA-ι-卡拉膠體系令EGCG 具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和DPPH·清除活性。多糖的存在不僅能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)在熱處理中構(gòu)象變化和減少大集聚體的形成[7，11]，也能進(jìn)一步提高樣品的包埋率。李陽[12]研究表明經(jīng)熱處理制得的β-乳球蛋白-阿拉伯膠納米顆粒，對不同濃度EGCG 溶液的包埋率均高于純?chǔ)?乳球蛋白納米顆粒。此外，關(guān)于制得的蛋白質(zhì)-多糖納米顆粒大小、Zeta 電位和穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)濃度、蛋白質(zhì)與多糖比例、多糖類型、緩沖液pH 值及濃度、熱處理溫度和時(shí)間等因素密切相關(guān)[13-14]。

目前有關(guān)蛋白質(zhì)-多糖納米顆粒包載多酚類物質(zhì)的研究主要集中在以EGCG、姜黃素等常見多酚類物質(zhì)為芯材，探究不同類型蛋白質(zhì)-多糖體系對多酚的包埋效果和多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)理等方面。以植物多酚提取物為芯材，制備多酚-蛋白質(zhì)-多糖納米顆粒和優(yōu)化制備工藝的研究較少。本研究以枇杷花多酚為芯材，以常見載體蛋白-BSA 和陰離子多糖-ι-卡拉膠為包埋材料，通過熱處理制備枇杷花多酚納米顆粒。以包埋率為指標(biāo)，通過篩選納米顆粒制備過程中的重要影響因素，設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳制備工藝，并對最佳工藝下制得的枇杷花多酚納米顆粒進(jìn)行特性研究。本研究為多酚活性的保持和其它植物提取物中多酚類物質(zhì)納米顆粒的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷花（早鐘六號），中國福建漳州；牛血清白蛋白（BSA）、福林酚，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ι-卡拉膠，上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基 （DPPH·）（純度＞97%），日本東京化成工業(yè)公司；其它試劑均為分析純級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；10Kd超濾離心管，法國密理博公司；Centrifuge 5427R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司；UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Zetasizer Nano ZS90 納米粒度電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；S-4800 掃描電子顯微鏡，日立高科公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枇杷花多酚的純化 取適量枇杷花粉末，按料液比為1∶20 加入70%乙醇溶液，水浴60 ℃，提取2 h，抽濾。濾液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，50 ℃烘干至恒重，得到多酚粗提物。將粗提物用適量去離子水溶解后，依此用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取（極性從小到大），萃取液和水相，經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，50 ℃烘干至恒重，得到石油醚相（PF）、二氯甲烷相（DF）、乙酸乙酯相（AF）、正丁醇相（BF）和水相（WF）萃取物。

1.3.2 多酚含量及DPPH·清除活性的測定 采用Folin-Ciocalteu 法[15]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定各萃取物多酚含量；參考Islam 等[16]的方法測定各萃取物的DPPH·清除活性。將高含量且高活性萃取物作為芯材，置于4 ℃的冰箱中避光儲(chǔ)藏，備用。

1.3.3 枇杷花多酚納米顆粒的制備及包埋率的測定 參考Li 等[10]的方法并稍作修改。將BSA 及ι-卡拉膠溶于30 mmol/L 的磷酸緩沖液（PBS）中，混合均勻。芯材溶于50%乙醇中，現(xiàn)配現(xiàn)用。取1.9 mL 的BSA-ι-卡拉膠復(fù)合溶液水浴加熱20 min，冷卻至室溫，加入0.1 mL 芯材溶液，快速漩渦混合20 s，得枇杷花多酚納米顆粒。取一定量的枇杷花多酚納米顆粒移入超濾濃縮離心管中，4 ℃下8 000 r/min 離心50 min，得到游離的枇杷花多酚溶液，測定游離多酚的量，按式（1）計(jì)算包埋率：

1.3.4 枇杷花多酚納米顆粒單因素實(shí)驗(yàn) 基本工藝參數(shù)為：PBS 的pH 值為6.4、ι-卡拉膠與BSA的質(zhì)量比為4∶15、BSA 與芯材質(zhì)量比為7∶1、BSA質(zhì)量濃度為2 mg/mL、水浴加熱溫度為80 ℃。在其它因素不變的情況下，選擇PBS 的pH 值分別為5.6，6.0，6.4，6.8，7.2；ι-卡拉膠與BSA 的質(zhì)量比分別為0∶15，2∶15，4∶15，6∶15，8∶15；BSA 與芯材質(zhì)量比分別為7∶1，14∶1，21∶1，35∶1，42∶1；BSA 質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2，3，4 mg/mL；水浴加熱溫度分別為50，60，70，80、90 ℃，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對枇杷花多酚包埋率的影響。

1.3.5 枇杷花多酚納米顆粒響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定BSA 質(zhì)量濃度為1 mg/mL，水浴加熱溫度為80 ℃，選取PBS 的pH（A）、ι-卡拉膠與BSA 的質(zhì)量比（B）、BSA 與芯材質(zhì)量比（C）為考察因素，以包埋率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn)，以確定最佳包埋工藝，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 枇杷花多酚納米顆粒特性研究

1.3.6.1 粒徑和Zeta 電位的測定 利用納米粒度電位分析儀測定枇杷花多酚納米顆粒的粒徑分布、平均粒徑及Zeta 電位。檢測條件：掃描波長633 nm，散射角90°，溫度25 ℃，測量前樣品在測量池中平衡2 min。

1.3.6.2 掃描電鏡分析 利用掃描電鏡觀察枇杷花多酚納米顆粒的微觀形態(tài)。取適量樣黏貼于載樣臺(tái)，進(jìn)行電鏡觀察，加速電壓為5 kV。

1.3.6.3 枇杷花多酚穩(wěn)定性試驗(yàn) 將未經(jīng)包埋的枇杷花多酚和多酚納米顆粒（多酚濃度相同）分別于常溫避光、常溫光照、避光水浴60 ℃及避光水浴80 ℃的環(huán)境下，靜置9 h。根據(jù)試驗(yàn)前、后對DPPH·清除活性的變化，判斷包埋處理對枇杷花多酚穩(wěn)定性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次以上，采用IBM SPSS Statistics 21 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05），采用Design-Expert 8.0 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Origin 9.0 作圖。

其中SPO代表RDF三元組中的主體、謂詞和客體。t是一個(gè)自然數(shù)，用來代表時(shí)間，表示在t時(shí)刻s的p屬性值為o是有效的。

2 結(jié)果與分析

2.1 各萃取物多酚含量及DPPH·清除活性

枇杷花多酚粗提物各萃取物的多酚含量及DPPH·清除活性如圖1所示。AF 的多酚含量為（424.49±1.54）mg GAE/g，在相同試驗(yàn)質(zhì)量濃度下（25 μg/mL）對DPPH·的清除率為（90.50±0.44）%，兩者均高于其它萃取物，故選擇其作為后續(xù)試驗(yàn)芯材。

圖1 各萃取物多酚含量及DPPH·清除活性Fig.1 Polyphenol content and DPPH· scavenging activity of extracts

2.2 枇杷花多酚納米顆粒的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 PBS 的pH 值對多酚包埋率的影響 圖2為PBS 的pH 值對多酚包埋率的影響。隨著pH 值的增加包埋率顯著增加，當(dāng)pH 值為6.4 和6.8時(shí)，包埋率最大，兩者無顯著差異，繼續(xù)增加pH值，包埋率顯著降低。推測這是因?yàn)樵赑BS 的pH值逐漸接近等電點(diǎn)時(shí)，BSA 與ι-卡拉膠之間的相互作用加強(qiáng)，兩者在熱處理時(shí)不易解離，且易碰撞形成大聚集體，阻礙了樣品與內(nèi)部蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的結(jié)合。當(dāng)PBS 的pH 值較大時(shí)，BSA 與ι-卡拉膠的吸引較弱，部分蛋白質(zhì)以游離態(tài)存在，而形成蛋白質(zhì)-多糖靜電復(fù)合物的蛋白質(zhì)在熱處理過程中易被釋放，易形成純蛋白質(zhì)的聚集體[17]，因而減少了BSA-ι-卡拉膠顆粒的形成，令包埋率降低。

圖2 pH 值對包埋率的影響Fig.2 Effects of pH value on the embedding rate

2.2.2 ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比對多酚包埋率的影響 圖3為ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比對多酚包埋率的影響。當(dāng)ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比為2∶15 及4∶15 時(shí)，包埋率最大，兩者間無顯著差異，進(jìn)一步提高ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比，包埋率降低至與未添加卡拉膠試驗(yàn)組無顯著差異。原因在于，適量的多糖有助于在熱處理過程中防止BSA 折疊結(jié)構(gòu)的過度展開，避免蛋白質(zhì)間的聚集析出現(xiàn)象，提高BSA 溶解度[10]。徐樂顏等[9]的研究顯示，姜黃素與BSA-К-卡拉膠、BSA-λ-卡拉膠間的結(jié)合常數(shù)均高于與純BSA 間的結(jié)合常數(shù)，表現(xiàn)出更好的包載性能。隨著ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比的進(jìn)一步加大，推測多余的ι-卡拉膠在體系冷卻過程中，更密集地結(jié)合在蛋白聚集體的表面或在小顆粒間起到連接作用，促進(jìn)大集聚體的形成，從而阻礙多酚與內(nèi)部蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)結(jié)合，令包埋率降低。

圖3 ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比對包埋率的影響Fig.3 Effects of mass ratio of ι-carrageenan to BSA on the embedding rate

2.2.3 BSA 與芯材質(zhì)量比對多酚包埋率的影響 圖4為BSA 與芯材質(zhì)量比對多酚包埋率的影響。當(dāng)BSA 與芯材質(zhì)量比為14∶1 和21∶1 時(shí)，包埋率最大，兩者間無顯著差異。芯材投入量較高（BSA 與芯材質(zhì)量比為7∶1）和較低（BSA 與芯材質(zhì)量比為28∶1，35∶1） 的試驗(yàn)組對多酚的包埋率較低。原因在于，體系中較低濃度的芯材，不利于BSA-ι-卡拉膠顆粒對多酚的捕捉，而過高濃度的芯材存在包載飽和的問題，從而導(dǎo)致包埋率較低。

圖4 BSA 與芯材質(zhì)量比對包埋率的影響Fig.4 Effects of mass ratio of BSA to core on the embedding rate

2.2.4 BSA 質(zhì)量濃度對多酚包埋率的影響 圖5為BSA 質(zhì)量濃度對枇杷花多酚包埋率的影響。當(dāng)BSA 質(zhì)量濃度為0.5，1 mg/mL 時(shí)，包埋率無顯著差異，隨著BSA 質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，多酚包埋率逐漸降低。有研究表明，隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，蛋白質(zhì)集聚體成長的增速大于形成新集聚體的增速[18]。Jones 等[14]研究報(bào)道了蛋白質(zhì)-多糖顆粒平均粒徑隨著蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度增加而增大，推測由更多BSA 及ι-卡拉膠所形成的大顆粒其內(nèi)部疏水口袋不利于捕捉游離的多酚。綜上，選擇BSA 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 作為后續(xù)試驗(yàn)的固定條件。

圖5 BSA 質(zhì)量濃度對包埋率的影響Fig.5 Effects of mass concentration of BSA on the embedding rate

圖6 熱處理溫度對包埋率的影響Fig.6 Effects of temperature of heat treatment on the embedding rate

2.3 枇杷花多酚納米顆粒的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。通過軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到多酚包埋率（Y）對自變量pH（A）、ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比（B）和ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

Y=82.17+1.12A-0.90B+1.03C-0.063AB-0.27AC+1.53BC-1.41A2-2.59B2-2.56C2

回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析見表3?；貧w模型的P 值為0.0006<0.01，說明模型高度顯著。失擬項(xiàng)為0.0896，沒有達(dá)到顯著水平，說明模型可以用來分析該工藝條件。獨(dú)立變量A 和二次項(xiàng)變量B2、C2對包埋率的影響達(dá)到極顯著水平；獨(dú)立變量B、C 和二次項(xiàng)變量A2對包埋率的影響達(dá)到顯著水平，表明這3 個(gè)因素與多酚包埋率有直接關(guān)系。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

通過響應(yīng)面圖形可以直觀反映各因素以及兩因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。圖7為控制因素A 在0 水平，包埋率對因素B、C 所做的響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線圖的輪廓形狀反映了因素間不同程度的交互作用。因素B、C 之間存在明顯的交互作用，并對多酚包埋率有極顯著影響。

圖7 因素B、C 交互作用對包埋率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of interaction between factor B and C on the embedding rate

通過軟件分析，枇杷花多酚納米顆粒的最佳包埋條件為：pH=6.57，ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比3.75∶15，BSA 與芯材質(zhì)量比14.95∶1，在此條件下多酚包埋率為82.52%?？紤]實(shí)際，將最優(yōu)工藝修正為：pH=6.6，ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比4∶15，BSA與芯材質(zhì)量比15∶1，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示枇杷花多酚的包埋率為（82.12±0.48）%，與預(yù)測值無顯著性差異，說明二次項(xiàng)回歸模型具有較好的精確度與適用度，能夠用于優(yōu)化枇杷花多酚納米顆粒的包埋工藝。

2.4 枇杷花多酚納米顆粒的特性分析

2.4.1 粒徑、電位及掃描電鏡分析 在最佳制備工藝條件下所制得的枇杷花多酚納米顆粒其粒徑分布、Zeta 電位和微觀形態(tài)分別如圖8所示。測得其平均粒徑為（126.0±5.38）nm，PDI 為0.43±0.02，屬于適中分散分布。納米顆粒的電位為（-31.1±0.42）mV，電位絕對值大于30 mV，表明所制備的納米顆粒間具有較大斥力，穩(wěn)定性較好[22]。掃描電鏡下觀察多酚納米顆粒的微觀形態(tài)，顆粒大致呈球形。

圖8 枇杷花多酚納米顆粒的粒徑分布（a）、Zeta 電位（b）和掃描電鏡圖（c）Fig.8 Particle size distribution （a），Zeta potential （b） and scanning electron microscopy（c） plots of loquat flower polyphenol nanoparticles

2.4.2 枇杷花多酚穩(wěn)定性試驗(yàn) 測定未經(jīng)包埋的枇杷花多酚和多酚納米顆粒在各處理試驗(yàn)前、后DPPH·清除活性的變化，結(jié)果見圖9。未經(jīng)包埋的多酚經(jīng)各處理試驗(yàn)后與對照相比，其DPPH·清除活性均顯著低于對照，加熱處理相較于避光及光照處理對活性的影響更大，且隨處理溫度的增高清除活性顯著減弱。而多酚納米顆粒在常溫避光、常溫光照和避光60 ℃處理后，清除活性與對照無顯著差異，經(jīng)避光80 ℃處理后，清除活性略有降低。因此經(jīng)包埋處理的枇杷花多酚納米顆粒較未經(jīng)包埋處理的枇杷花多酚，經(jīng)各處理試驗(yàn)后均能更好的保持DPPH·清除活性，穩(wěn)定性強(qiáng)。

圖9 不同處理對未經(jīng)包埋多酚（a）和多酚納米顆粒（b）DPPH·清除活性的影響Fig.9 Effects of different treatments on the DPPH·scavenging activity of free polyphenols （a）and polyphenols nanoparticles （b）

3 結(jié)論

枇杷花醇提物各萃取物中，AF 多酚含量為（424.49±1.54）mg GAE/g，對DPPH·的清除率為（90.50±0.44）%，兩者均顯著高于其它萃取物，故選擇其作為試驗(yàn)芯材。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化枇杷花多酚納米顆粒的制備工藝為：PBS 的pH=6.6，ι-卡拉膠與BSA 質(zhì)量比4∶15，BSA 與芯材質(zhì)量比15∶1，BSA 質(zhì)量濃度1 mg/mL，熱處理溫度80 ℃，此時(shí)枇杷花多酚包埋率為（82.12±0.48）%。在最佳制備工藝條件下制備多酚納米顆粒，其平均粒徑為（126.0±5.38）nm，PDI 為0.43±0.02，粒徑分布適中，Zeta 電位為（-31.1±0.42）mV，掃描件電鏡下觀察到多酚納米顆粒大致呈球形。由穩(wěn)定性試驗(yàn)可知，經(jīng)包埋處理后的枇杷花多酚能更好的保持DPPH·清除活性，穩(wěn)定性強(qiáng)。本研究為保持多酚穩(wěn)定性和植物多酚相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用提供了參考。