卡拉膠酶的來源、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與應用研究進展

郭子龍，唐天城，徐寅嘯，朱本偉，姚 忠,寧利敏

(1.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800)(2.南京中醫(yī)藥大學 醫(yī)學院·整合醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)

卡拉膠是紅藻(如Eucheumamuricata和Gracilarialemaneiformis)細胞外基質(zhì)的重要組成部分，是一種由D-半乳糖通過交替的α-1,3和β-1,4糖苷鍵連接而成的線性硫酸多糖[1]。天然的卡拉膠往往不是均一的多糖，而是多種構(gòu)型的混合物。為滿足卡拉膠這種復雜結(jié)構(gòu)的研究需要，Knutsen等[2]提出了以大寫字母代替特定基團的命名方法(圖1)，根據(jù)硫酸基團的數(shù)量和位置以及α-1,4-連接的-半乳糖殘基中3,6-內(nèi)醚-α-D-吡喃半乳糖(3,6-AG)的存在，將其分為κ-、ι-和λ-型3種卡拉膠，所對應的重復二糖結(jié)構(gòu)分別為G4S-DA、G4S-DA2S和G2S-D2S，6S[3]。由于卡拉膠具有良好的成膠能力、化學穩(wěn)定性和多種生理活性，卡拉膠在食品、飲料和化妝品等行業(yè)都得到了廣泛的應用，還可作為食品增稠劑、澄清劑和凝膠劑等[4-6]。然而，這種硫酸多糖的溶解性差、生物利用度低，其應用也受到了限制[7]。卡拉膠寡糖是卡拉膠的降解產(chǎn)物，具有多種生物活性，如抗炎[8]、抗凝血[9]和抗腫瘤等活性[10-11]，此外，它們還具有良好的溶解性和生物利用度[12]。因此，卡拉膠寡糖的制備方法引起了人們越來越多的關(guān)注[13]，其中，化學水解和酶降解是較為成熟的制備方法。由于化學水解反應過程往往過于劇烈，在水解過程中會造成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的破壞，因此其應用受到了極大的限制[14]。而利用卡拉膠酶進行特異性降解的方式由于具有反應條件溫和、產(chǎn)物特異性好等優(yōu)點，所以被認為是一種具有廣闊前景的方法[15]。

圖1 不同構(gòu)型的卡拉膠結(jié)構(gòu)示意[2]Fig.1 Schematic diagram of carrageenans with different structures[2]

卡拉膠酶屬于糖苷水解酶，目前已發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶在作用模式上均屬于內(nèi)切酶，該酶作用于卡拉膠分子內(nèi)的β-1，4糖苷鏈，產(chǎn)生一系列聚合度為偶數(shù)的卡拉膠寡糖。多種海洋細菌均具備產(chǎn)生卡拉膠酶來利用這種多糖的能力，這對海洋中的碳循環(huán)至關(guān)重要。本課題組從海洋細菌PedobacterhainanensisNJ-02中克隆、異源表達和表征了編碼新κ-卡拉膠酶的基因(cgkA)，該酶可將卡拉膠內(nèi)切為κ-卡拉膠四糖與六糖，這對于生產(chǎn)高聚合度(Dps)值的卡拉膠寡糖是一種具有潛在價值的酶工具[16]。近年來，海洋微生物降解和利用卡拉膠的研究主要集中在卡拉膠酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能分析和生化途徑的闡明等方面。本文總結(jié)了不同來源的卡拉膠酶的分類和性質(zhì)，還研究了其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，為推動卡拉膠酶的深入研究和開發(fā)應用奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

1 卡拉膠酶來源、種類、性質(zhì)與降解模式

卡拉膠酶主要從海洋細菌和海洋動物的消化液中分離得到。Skea等[17]首次成功地從海洋軟體動物中純化并表征了卡拉膠酶。迄今為止，所有報道的卡拉膠酶都具有嚴格的底物專一性，僅能降解一種構(gòu)型的卡拉膠。因此，可將卡拉膠酶分為κ-卡拉膠酶(EC 3.2.1.83)、ι-卡拉膠酶(EC 3.2.1.157)和λ-卡拉膠酶(EC 3.2.1.162)。表1列出了不同來源卡拉膠酶及其酶學性質(zhì)。由表1可知：能夠產(chǎn)生卡拉膠酶的細菌包括Pseudoalteromonas、Pseudomonas、Shewanella、Vibrio、Cellulophaga、Cytophaga、Tamlana、Microbulbifer、Alteromonas、Pedobacter和Zobellia等，其中，κ-卡拉膠酶分布最為廣泛，屬于糖苷水解酶16家族。目前，已報道有多種菌株可以產(chǎn)生κ-卡拉膠酶，如Shewanellasp.Kz7[14]、Pseudoalteromonassp. ZDY3[18]、Pseudoalteromonassp.Q203[19-20]、Pseudoalteromonassp.Q202[21]、P.aeruginosaZSL-2[22]、P.carrageenovoraHLX250[23]、P.elongataMTCC 5261[24]、P.porphyraeLL-1[25]、Pseudoalteromonassp.WZUC10[26]、P.carrageenovoraNCMB 302[27]、Pseudoalteromonassp.AJ5-13[28]、P.tetraodonisJAM-K142[29]、Vibriosp.SY01[30]、Vibriosp.NJ-2[31]、Vibriosp.CA-1004[32]、Tamlanasp.HC4[33]、P.hainanensis13-Q[34]和A.macleodiiKS62[35]等。海洋黃桿菌Z.galactanivorans可以降解瓊脂、褐藻膠和卡拉膠等多種多糖[36]。它能夠通過產(chǎn)生κ-卡拉膠酶來降解和利用紅藻多糖[37-39]。菌株CellulophagalyticaN5-2也可以通過產(chǎn)生κ-卡拉膠酶降解多糖[9,40]。Cytophagastrains MCA-2和Ik-C783也被報道可以產(chǎn)生κ-卡拉膠酶[41-42]。Kalitnik等[43]從紅藻Tichocarpuscrinitus中篩選出28株具有降解κ-卡拉膠能力的菌株，且它們均屬于Bacteroidetes和Proteobacteria。Kang等[44]通過構(gòu)建瓊脂酶、κ-卡拉膠酶和新瓊脂二糖酶的混合體系來降解紅藻類底物，發(fā)現(xiàn)其還原糖的產(chǎn)量是單酶還原糖產(chǎn)量的3.6倍。Li等[45]從一種溫泉細菌BacillusBI-19中獲得了一段編碼α-淀粉酶的基因amy19，異源表達后發(fā)現(xiàn)重組Amy19具有降解κ-卡拉膠的活性。同樣地，Liu等[46]在海洋弧菌Vibrioalginolyticus63中也克隆得到了一個具有κ-卡拉膠降解活性的α-淀粉酶。Wu[47]采用商品化的α-淀粉酶來降解卡拉膠制備卡拉膠寡糖也證明了一些α-淀粉酶具有卡拉膠酶的活性。此外，一些革蘭氏陽性菌如芽孢桿菌可以降解瓊脂和卡拉膠。Bacillussp. SYR4通過利用其產(chǎn)生的瓊脂酶和卡拉膠酶(主要是κ-卡拉膠酶)的活性來降解利用紅藻廢料[48]，Bacillussp. HT19也可以通過產(chǎn)生κ-卡拉膠酶利用卡拉膠多糖[49]。Yu等[50]通過利用雙啟動子、共表達伴侶蛋白和轉(zhuǎn)錄因子增強了重組κ-卡拉膠酶在Pichiapastoris中的表達。Wang等[51]表征了一種深海細菌Bacillussp. N1-1的全基因組，并發(fā)現(xiàn)其可以降解κ-硒代卡拉膠。在海洋無脊椎動物Turbocornutus的腸道中可以分離出一種能降解瓊脂、藻酸鹽和κ-卡拉膠的MicrobulbiferagarilyticusGP101，同時該菌株的基因組測序結(jié)果被公布[52]。在Cellulosimicrobium培養(yǎng)體系中也檢測到κ-卡拉膠酶活性[53-54]。

對于ι-卡拉膠酶的報道較少，僅有Altertermonasfortis[55]、Cellulophaga[56-57]、Microbulbifer[58]、Flavobacterium[59]和Wenyingzhuangia[60]等少數(shù)菌株。ι-卡拉膠酶首次從Altertermonasfortis中被提取并表征[55]。更重要的是,該酶的三維結(jié)構(gòu)和催化作用機制也都得以闡明[61]。Xu等[62]開發(fā)了一種新的整合載體(pBCGA)，用于在Brevibacilluschoshinensis中高效表達優(yōu)化的ι-卡拉膠酶基因(CGIOP)，并純化表征了該基因的重組酶rCgiA。Hatada等[58]在深海細菌MicrobulbiferthermacoleansJAMBA94T中發(fā)現(xiàn)了一種新的ι-卡拉膠酶，并通過定點突變來闡釋了其催化機制。Liu等[46]從海洋細菌Flavobacteriumsp.YS-80-122中克隆并表征了一種溫度穩(wěn)定性較高的ι-卡拉膠酶。Ma等[56-57]從Celluphagasp. QY3中鑒定了兩種新的ι-卡拉膠酶。Shen等[60]從Wenyingzhuangiafucanilytica中克隆了一種編碼GH82家族新的ι-卡拉膠的基因并對重組酶的性質(zhì)進行了研究。Muzyed等[63]通過單因素試驗對Cellulophagabaltica生產(chǎn)ι-卡拉膠酶的工藝進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后酶的比酶活比未優(yōu)化時的比酶活高26倍。

關(guān)于λ-卡拉膠酶的報道很少，更缺少相關(guān)的基因序列信息，因此它構(gòu)成了與κ-卡拉膠酶和ι-卡拉膠酶不相關(guān)的新GH家族[64]。目前，λ-卡拉膠酶的相關(guān)報道僅有為數(shù)不多的幾種，包括一種熱泉細菌Bacillussp. Lc50-1，它可以生產(chǎn)一種溫度穩(wěn)定性較高的λ-卡拉膠酶[65]。Naik等[66]分離出3株具有生產(chǎn)瓊脂酶、λ-卡拉膠酶、淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力的Ulvalactuca類細菌。另外，有2種λ-卡拉膠酶的基因已經(jīng)被克隆，一種來自海藻細菌Pseudoalteromonascarrageenovora[67]，另一種來自深海細菌Pseudoalteromonassp. CL19[68]。這些λ-卡拉膠酶基因的序列高度相似(同源性98%)，序列信息的缺乏導致了至今仍沒有將其定義為CAZy的家族成員。隨著微生物基因組學不斷發(fā)展，越來越多具有降解多糖能力的海洋微生物被基因測序[36-37]，因此，研究者通過對CAZy數(shù)據(jù)庫中的基因數(shù)據(jù)分析，闡明了水解酶降解多糖的原理并發(fā)現(xiàn)了一些菌株中與編碼其水解功能有關(guān)的關(guān)鍵基因[69]。因此，發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良特性且具有工業(yè)應用潛力的新型卡拉膠酶顯得尤為重要。

不同來源的卡拉膠酶有著不同的分子量，其大小分布較廣(3.0×104～1.28×105)。如，來自Cytophagasp.MCA-2的CgkMCA-2[41]和來自Pseudoalteromonassp.ASY5的CgkASY[70]的分子量都是3.0×104。來自Pseudoalteromonassp. QY203的CgkP[19]、來自Pseudoalteromonassp. QY203的CgkP203[20]、來自Vibriosp. NJ-2的CgkA[31]、來自Vibriosp.的CgkCA[71]、來自Pseudoalteromonascarrageenovora的CgkPc[72]和來自Pseudoalteromonassp. AJ5-13的CgkPAJ5[28]都有著相近的分子量(約為3.5×104)。被表征的卡拉膠酶大多分子量為4.0×104～6.0×104，如來自PseudoalteromonasporphyraeLL-1的CgkP(4.0×104)[25]、來自PseudoalteromonastetraodonisJAM-K142的CgkA(4.3×104)[29]、來自Pseudoalteromonassp. QY203的CgkX(4.4×104)[19]、來自Shewanellasp. Kz7的CgkS(4.5×104)[14]、來自Zobelliasp. ZM-2的CgkZM-2(4.5×104)[73]和來自Pseudoalteromonassp. WZUC10的CgkP(4.5×104)[26]等。同時，來自CellulophagalyticaN5-2的Cly-κ-CAR(5.5×104)[40]、來自Zobelliagalactanivorans的CgkA(5.7×104)[37]、來自Tamlanasp. HC4的CgkT(6.64×104)[33]、來自Pedobacterhainanensis的CgkP(6.5×104)[34]、來自Cellulophagasp. QY3的CgiA(5.58×104)[56]、來自Cellulophagasp. QY3的CgiB(5.06×104)[57]、來自MicrobulbiferthermotoleransJAMB-A94T的CgiM(5.5×104)[58]則呈現(xiàn)出較大的分子量。另外，來自Cytophagasp. lk-C783的兩種κ-卡拉膠酶(Cglk)[42]、來自Pseudomonaselongata的CgkPe[24]、來自Pseudoalteromonascarrageenovora的兩種λ-卡拉膠酶(CglPc)[64]、來自Pseudoalteromonassp. CL19的CglCL19[68]則呈現(xiàn)出更大的分子量(>1.0×105)。絕大多數(shù)表征過的κ-卡拉膠酶的最適溫度在30～40 ℃。但是，來自PseudoalteromonasporphyraeLL1的CgkP[25]、來自Pseudoalteromonassp. QY203的CgkX[19]、來自Pseudoalteromonassp. AJ5-13的CgkAJ5[28]和來自PseudoalteromonastetraodonisJAM-K142的CgkA[29]則都在55 ℃時展現(xiàn)出最大酶活性。另外，來自Pseudoalteromonassp. ASY5的CgkASY最適溫度是60 ℃[70]。有趣的是，來自Cytophagasp. lk-C783的Cgklk在25 ℃環(huán)境下酶活性最高，這主要是由酶的分離環(huán)境所決定[43]。從溫泉細菌Bacillussp. Lc50-1中分離的λ-卡拉膠酶最適反應溫度是75 ℃，展現(xiàn)出工業(yè)應用的巨大潛力[7]。幾乎所有表征過的酶的最適pH為7.0～8.0，但是來自Pseudomonaselongata的CgkPe最適pH為5.6～7.7[24]。對于卡拉膠酶促動力學，不同的酶相應的Km也會有所不同。來自Shewanellasp. Kz7的CgkS(0.15 mg/mL)[14]和來自Zobelliasp. ZM-2的CgkZM-2(0.84 mg/mL)[77]的Km比其他卡拉膠酶的低，表明這兩種酶對于卡拉膠底物的親和度相比較于其他酶更高。其他的κ-卡拉膠酶，如來自PseudoalteromonasporphyraeLL1(4.4 mg/mL)[25]、Vibriosp. CA-1004 (3.3 mg/mL)[32]、Tamlanasp. HC4(7.63 mg/mL)[33]、Pseudoalteromonassp. AJ5-13 (9.8 mg/mL)[28]和Pseudoalteromonaselongata(6.6 mg/mL)[24]的卡拉膠酶則顯示出對卡拉膠底物較低的親和力。

表1 不同來源卡拉膠酶的酶學性質(zhì)

不同的金屬離子和化學試劑對不同細菌來源的卡拉膠酶活性有不同的影響，這在學術(shù)界已經(jīng)達成了共識。大多數(shù)情況下，Na+、K+、Ca2+和Mg2+可以激活酶活性。特別是高濃度Na+(達到500 mmol/L)可顯著提高酶活性[28]。據(jù)推測應該是高濃度NaCl會改變卡拉膠的物理性質(zhì)，從而影響酶的反應。然而，K+對來自Pseudomonaselongata的CgkPe[24]、來自Tamlanasp. HC4的CgkT[33]和來自Brevibacilluschoshinensis的rCgiA[62]均有抑制作用。幾乎所有的卡拉膠酶都被Co2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+和Hg2+等重金屬所抑制，可能是金屬離子與活性中心的催化殘基相互作用，從而改變了酶的構(gòu)象。所有的卡拉膠酶都能將卡拉膠水解成偶數(shù)寡糖，這說明它們的作用模式為順向內(nèi)切。κ-和ι-卡拉膠酶沿著多糖鏈依次水解所有糖苷鍵，得到聚合度(DP)分別為2和4的寡糖[72,74]。而λ-卡拉膠酶則隨機破壞糖苷鍵，產(chǎn)生大量聚合度為6的寡糖[64]。偶數(shù)聚合度寡糖的產(chǎn)生，主要取決于卡拉膠的重復二糖單元和相應的水解機制。據(jù)推測，含有4個殘基的四糖鏈起到了與底物結(jié)合和降解的作用[38]。綜上所述，這3種卡拉膠酶都是內(nèi)切型水解酶，它們可以破壞內(nèi)部糖苷鍵，而不是水解還原端和非還原端單元。

2 不同種類的卡拉膠酶序列分析

到目前為止，已經(jīng)10余個κ-卡拉膠酶的基因被克隆和鑒定[14,18,28,32,37,40,50]。然而，來自P.porphyraeLL-1的CgkP和來自P.tetraodonisJAM-K142的CgkA與來自P.carrageenovora的酶具有很高的同源性(分別為92%和98%)[24,28]。因此，這3種酶被認為是同一種卡拉膠酶。對這3種酶進行多序列比對，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同來源的κ-卡拉膠酶的多序列對比Fig.2 Multi-sequence alignment of κ-carrageenases from different sources

由圖2可發(fā)現(xiàn)，3個高度保守的區(qū)域，即“GVC/SPS/AFW”“YSEIDVVEL”和“TLSL/QGLR”[74]。更重要的是，參與底物結(jié)合和活性催化所必需的幾個殘基在這些序列中都高度保守，如Glu171、Asp173、Glu176、Asp194、Leu197、Ser271和Leu274，其中3個殘基(Glu171、Asp173和Glu176)參與底物的結(jié)合[72]。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫的分類，κ-卡拉膠酶屬于GH16水解家族，這個家族包括了許多具有不同底物特異性的水解酶，如β-瓊脂酶、地衣酶、海帶酶和β-半乳甘露聚糖酶。這些水解酶擁有類似的基因序列，因此推斷是從共同的祖先進化而來。值得注意的是，κ-卡拉膠酶已從β-瓊脂水解酶分支中分離出來[74]，但考慮到κ-卡拉膠和瓊脂的結(jié)構(gòu)相似性，將他們的2種水解酶都歸類于GH-B族，并猜測其具有相同的底物降解機制。

目前，已經(jīng)有8個ι-卡拉膠酶的基因被克隆分析。首先是從Alteromonasfortis中克隆了第一個ι-卡拉膠酶基因，并由此定義了GH82家族[55]。Ma等[56-57]從Cellulophagasp.QY3中克隆并鑒定了2個ι-卡拉膠酶基因。Hatada等[58]發(fā)現(xiàn)了來自MicrobulbiferthermotoleransJAMB-A94T的一種新的ι-卡拉膠酶基因。Li等[59]從細菌Flavobacteriumsp.YS-80-122中克隆了一種新的耐冷熱的ι-卡拉膠酶基因。Shen等[60]從Wenyingzhuangiafucanilytica中克隆了一種新的ι-卡拉膠酶的基因。Xu等[62]從Brevibacilluschoshinensis中克隆表達了一種ι-卡拉膠酶基因。圖3展示了ι-卡拉膠酶的多序列對比結(jié)果。由圖3可知，對催化活性來說，關(guān)鍵的殘基(即Glu364和His406)在序列中高度保守。此外，參與底物結(jié)合的殘基(如Gly336、Tyr337、Gly338、Gln341和Arg362)在序列中也呈現(xiàn)保守的狀態(tài)[74]。目前為止，只發(fā)現(xiàn)了2種λ-卡拉膠酶的基因，它們的同源性達到98%。

圖3 不同來源的ι-卡拉膠酶的多序列對比Fig.3 Multi-sequence alignment of ι-carrageenases

圖4 不同家族的卡拉膠酶的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of carrageenases from different families

為了闡明3個不同類群之間的進化關(guān)系，在序列比對的基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。由圖4可知：3種卡拉膠酶聚集成了3個小的分支，說明與κ-卡拉膠酶相比，λ-卡拉膠酶比ι-卡拉膠酶具有更高的同源性。由于缺乏λ-卡拉膠酶的序列信息，這一結(jié)論未得到證實[75]。雖然這3種卡拉膠酶對結(jié)構(gòu)相關(guān)的底物具有特異性，但是它們在序列上的同源性較低。這些酶主要通過識別3種卡拉膠中的半乳糖重復單元的硫酸化模式來區(qū)分它們的底物。在結(jié)構(gòu)上，κ-卡拉膠由中性糖殘基和負電荷糖殘基組成，而κ-卡拉膠酶則通過與一些保守殘基(Glu171、Asp173和Glu176)的相互作用來識別底物[75]。ι-卡拉膠由帶負電荷的二糖單元組成，其反應機制可能是底物與保守的精氨酸殘基反應結(jié)合在一起[76]。

3 卡拉膠酶的結(jié)構(gòu)和催化機制

卡拉膠酶在結(jié)構(gòu)層面上的表征和研究還不夠深入，但是隨著結(jié)構(gòu)生物學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的卡拉膠酶的結(jié)構(gòu)得以解析。到目前為止，有4種卡拉膠酶的晶體結(jié)構(gòu)被完全表征，即來自Pseudoalteromonascarrageenovora的κ-卡拉膠酶(CgkA)[74]、來自ZobelliagalactanivoransDsiJT的ZgCgkA[37]、來自Alteromonasfortis的ι-卡拉膠酶(CgiA)[61]以及來自Bacteroidesovatus的外切卡拉膠酶BovGH167[77]。CgkA和ZgCgkA都屬于β果凍卷折疊，主要由2個緊密包裹的彎曲反平行β板構(gòu)成(圖5)，形成了一個隧道活動場所，暗示著一種過程作用模式。根據(jù)二級分析，該折疊由3張小的反平行β板和一條α-螺旋組成。ZgCgkA與CgkA在結(jié)構(gòu)上沒有顯著性差異[38]，而其中一些細微的結(jié)構(gòu)差異可以通過結(jié)構(gòu)疊加來加以強調(diào)，包括催化通道的末端、附加的手指、存在于ZgCgkA頂部的一個螺旋等。這2種酶的機制是雙取代機制，涉及2個催化羧基，相應的親核成分和酸堿催化殘基分別為E163(親核)和E168(酸堿)。E168只與4種溶劑分子進行氫鍵連接，它們是催化進入水分子的候選分子。相反，E163與Y161定向地通過氫鍵牢固連接，存在于目前所表征的2種κ-卡拉膠酶中[37]。

圖5(c)為CgiA晶體結(jié)構(gòu)，它采用右旋β-螺旋折疊，與2個κ-卡拉膠酶的β果凍卷折疊無關(guān)。與CgkA和ZgCgkA相比,CgiA在C末端區(qū)具有2個附加的結(jié)構(gòu)域((a)和(b))。結(jié)構(gòu)域(a)類似于DNA/RNA結(jié)合蛋白并顯示了一個α/β-折疊，而結(jié)構(gòu)域(b)由具有2個二硫鍵組成的環(huán)構(gòu)成。與底物絡(luò)合的CgiA的結(jié)構(gòu)表明其中有幾個殘基參與底物結(jié)合， 即Asn123、Arg125、Lys163、Lys394、Arg243、Arg303、Gly423、Gln424、Tyr341、Arg321和Arg353。當?shù)孜锱c這些殘基結(jié)合時，結(jié)構(gòu)域(a)經(jīng)歷劇烈的構(gòu)象變化，向β-螺旋裂移動，因此形成一個含有四糖底物的隧道。同時，二聚體結(jié)合在N末端區(qū)，一個開放的構(gòu)象到一個封閉的隧道類似于一個啟動開關(guān)，這就從一個合理的角度解釋了這種高效的行動模式[61]。

圖5 不同家族的卡拉膠酶的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of carrageenases from different families

圖6 卡拉膠的降解機制Fig.6 Presentation of retaining mechanisms for the degradation of carrageenan

圖6為卡拉膠酶的反應機制。Glu245在CgiA中充當催化質(zhì)子供體的作用,而Asp247是激活催化水分子的通用堿。另外，3個殘基間接參與酶活性的激活：Gln222在連接催化H2O和Cl-的同時發(fā)揮構(gòu)建活性位點中水網(wǎng)絡(luò)的基本作用；His281參與ι-卡拉膠的結(jié)合并可能參與Glu245的質(zhì)子交換；而Glu310則起到了穩(wěn)定底物中間構(gòu)象的作用。但是，由于缺乏對卡拉膠序列的認知，卡拉膠的結(jié)構(gòu)信息仍然不足。微生物基因組學的發(fā)展為發(fā)現(xiàn)新的卡拉膠提供了有效的途徑。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學的進展，可以更高效地獲得定制酶的序列信息。此外，通過結(jié)合高通量篩選和最新的結(jié)構(gòu)生物學技術(shù)，如低溫電子顯微術(shù)，使得深入了解這些酶的結(jié)構(gòu)和反應機制成為可能。總之，新技術(shù)的發(fā)展與應用無疑將有利于研究卡拉膠的結(jié)構(gòu)信息，為其工業(yè)應用奠定堅實的基礎(chǔ)。

4 卡拉膠酶的生產(chǎn)、純化及活性測定方法研究

現(xiàn)有多種方法從復雜的發(fā)酵系統(tǒng)中提取卡拉膠酶以對其進行更加深入的研究。為了從野生菌株中提取卡拉膠酶并以此構(gòu)建重組工程菌株，規(guī)?；囵B(yǎng)是現(xiàn)在采用最多的方式。Dyrset等[78]構(gòu)建了卡拉膠酶的發(fā)酵系統(tǒng)，最終最大酶活達到84 000 U/L；此外，他們用等量的谷氨酸取代了酪氨酸，得到的最高酶活比先前報道的酶活高出17倍。Ziayoddin等[22]采用正交試驗法對PseudomonasaeruginosaZSL-2的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)的卡拉膠酶的最大酶活(257 U/mL)在對數(shù)后期出現(xiàn)，隨后卡拉膠酶的產(chǎn)量出現(xiàn)了下降的趨勢。Khambhaty等[79]對Pseudomonaselongata生產(chǎn)的κ-卡拉膠酶培養(yǎng)基組分進行了統(tǒng)計優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，與文獻[80]報道的培養(yǎng)基相比，κ-卡拉膠酶的產(chǎn)量增加了32倍(32.08 U/mg)。Guo等[81]采用Box-Behnken實驗設(shè)計并運用響應面法，優(yōu)化了Thalassospirasp. Fjfst-332生產(chǎn)卡拉膠酶的培養(yǎng)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Thalassospirasp. Fjfst-332的酶活最高為267 U/mL，是目前為止發(fā)現(xiàn)產(chǎn)κ-卡拉膠酶最具活力的野生細菌；同時在磁性Fe3O4-殼聚糖載體上對該菌株進行了固定化，以制備κ-卡拉膠酶和κ-卡拉膠寡糖，與游離菌相比，固定化菌株能在溫度更高、pH范圍更廣的情況下生產(chǎn)κ-卡拉膠酶。更重要的是，產(chǎn)生的κ-卡拉膠酶活性至少可以持續(xù)7個循環(huán)[82]。

為了擴大卡拉膠酶的生產(chǎn)規(guī)模，可采取克隆它們的基因，然后在工程菌株中進行異源表達的方法。Liu等[83]利用野生型信號序列增加κ-卡拉膠酶在Escherichiacoli的胞外生產(chǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)的51%的卡拉膠酶被分泌到培養(yǎng)基中，33%的卡拉膠酶積累到周質(zhì)空間中。這種重組κ-卡拉膠酶的高水平胞外分泌在卡拉膠酶的生產(chǎn)中有著廣泛的前景。Zhao等[84]在從Brevibacilluschoshinensis中生產(chǎn)ι-卡拉膠酶時建立了一個高水平的胞外表達系統(tǒng)，胞外ι-卡拉膠酶的最大酶活達到(51.5±1.2) U/mL。Yu等[85]將κ-卡拉膠酶基因插入畢赤酵母中，搖瓶發(fā)酵120 h后，重組酶的酶活達到4.68 U/mL。為了提高卡拉膠酶在工業(yè)應用中的穩(wěn)定性，已經(jīng)利用酶的固定化方法。Xu等[86]以戊二醛為偶聯(lián)劑，將來自Pseudoalteromonascarrageenovora的κ-卡拉膠酶固定在羧基功能化的磁鐵納米粒子中，測定固定化酶的比酶活和回收率分別為326.0 U/g和46.9%。隨后，Xiao等[87]制備了磁性氧化金屬納米粒子，并在納米粒子上固定了來自Pseudoalteromonassp. ASY5 的κ-卡拉膠酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化后的κ-卡拉膠酶具有更低的熱穩(wěn)定性和更好的pH穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性；此外，固定化的κ-卡拉膠酶在使用4次后依舊保持了原活性的43.5%，但是對底物的親和力有所降低。從復雜的蛋白質(zhì)混合物中純化卡拉膠酶的過程通常由幾個連續(xù)的操作組成。(NH4)2SO4沉淀通常作為從野生型菌株發(fā)酵系統(tǒng)中純化卡拉膠酶的初始步驟[9,20-21,23-24,26,28,33-34,69]。然后，采用離子交換色譜從粗酶制劑中提取酶。通常，陽離子交換劑可以將卡拉膠酶與堿性pI結(jié)合[25,28,33,42,72]，而陰離子交換柱與低pI的卡拉膠酶表現(xiàn)出特定的相互作用[21,23,26,59]。此外，凝膠過濾也被引入凈化程序中[9,24,31]。少有的幾種卡拉膠酶，如來自Pseudoalteromonassp.QY203的CgkP、來自Pseudoalteromonassp.CL19的CglCL19已經(jīng)通過疏水層析成功純化[20,68]。另一方面，因為重組卡拉膠酶含有組氨酸標記，通常用親和層析法進行純化[14,19,29,40,56-58,60,87]。

現(xiàn)在已有多種方法對卡拉膠酶的酶活進行檢測。如，在類水解酶活性的檢測中，隨著底物被生長的菌落生產(chǎn)的酶水解后，觀察到不透明介質(zhì)的液化或消耗，因此，在培養(yǎng)板上通過利用0.5%的氯化十六烷基吡啶篩選生產(chǎn)卡拉膠酶的微生物也是一種檢測卡拉膠酶活性的方法[88]。Smith等[89]利用酶譜法來測定卡拉膠酶活，原理為卡拉膠酶(以前用PAGE分離)可在覆蓋凝膠中降解其底物，而寡糖被洗滌后，剩下的底物被阿爾新藍染色，所以卡拉膠酶的活性在覆蓋凝膠上的區(qū)域清晰顯示出來。對于進一步的定量測定，通常采用二硝基水楊酸法測定卡拉膠水解過程中還原糖的增加量[90]。一個酶活單位被定義為每分鐘釋放1 μmol還原糖(D-半乳糖當量)所需要的酶量。此外，卡拉膠酶的酶活也可通過黏度法進行測定[91]。在適當?shù)臈l件下，利用水浴中的黏度計測量黏度，通過繪制黏度隨時間變化的反比值可以得到一條直線。此時，一單位的酶活被定義為單位時間內(nèi)使斜率上升0.000 1所需要的酶量[91]。

5 卡拉膠酶的應用

卡拉膠酶應用廣泛，其篩選與表征已經(jīng)成為海洋酶工程相關(guān)領(lǐng)域的焦點?？ɡz酶有作為生產(chǎn)寡糖的生物工具的巨大潛力，而生產(chǎn)的卡拉膠寡糖有許多功能活性。如，Yuan等[92]發(fā)現(xiàn)低分子量的卡拉膠寡糖具有抗腫瘤的作用。Aliste等[4]發(fā)現(xiàn)，卡拉膠寡糖具有抗血栓以及抑制ECV304細胞增殖、遷移的作用。另外，寡糖還顯示出抗氧化、抗病毒和增強免疫刺激活性的作用[14,93-97]?？ɡz寡糖的活性與其結(jié)構(gòu)、分子量、組成成分和硫酸基團的位置緊密相關(guān)[98]?？ɡz寡糖的酶法制備具有反應條件溫和、過程可控等優(yōu)點。酶法制備卡拉膠寡糖具有廣泛的應用前景[9,40,58,60]。

卡拉膠酶還用于分離和制備與其他酶結(jié)合的藻類原生質(zhì)體(如纖維素酶和酶)。Zablackis等[98]通過使用卡拉膠酶和纖維素酶從Kappaphycusalvarziivar.tambalang(Rhodophyta)分離原生質(zhì)體。Gross等[99]通過使用來自Pseudomonascarrageenovora的κ-卡拉膠酶從Gigartinacorymbifera中制備原生質(zhì)體。Gall等[100]使用ι-卡拉膠酶和κ-卡拉膠酶制備原生質(zhì)體。

因為酶類對不同結(jié)構(gòu)的底物具有嚴格的底物特異性，所以卡拉膠酶被廣泛用于闡明卡拉膠的精細結(jié)構(gòu)以及研究其在海洋細菌中的代謝過程[101]。Guibet等[102]用來自Pseudoalteromonassp. CL19的λ-卡拉膠酶研究了來自Gigartinaskottsbergii的λ-卡拉膠的精細結(jié)構(gòu)。Antonopoulos等[103]通過重組ι-卡拉膠酶降解ι-卡拉膠并用高效液相色譜法結(jié)合蒸發(fā)光散射測定其寡糖的結(jié)構(gòu)。此外，因為卡拉膠酶具有優(yōu)異的降解卡拉膠的能力，所以它也被廣泛用于紡織工業(yè)，特別是在印刷紡織品中用作增稠劑[104]。近年來，卡拉膠酶在海藻廢物處理中的應用引起了越來越多的關(guān)注[47]。因為海藻加工企業(yè)在生產(chǎn)加工時產(chǎn)生了大量含有卡拉膠多糖的廢料，造成了一定的環(huán)境問題，但是對于卡拉膠酶的進一步研究是降解卡拉膠廢料、保護生態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵。

6 結(jié)論與展望

近年來，卡拉膠酶以其廣泛的應用引起了人們的關(guān)注，大量研究已經(jīng)證明了卡拉膠酶在生物工業(yè)領(lǐng)域中有極大的潛在應用可能。本文總結(jié)了3種主要的卡拉膠酶的來源、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、機制及應用等方面的研究進展，為推動卡拉膠酶的深入研究和開發(fā)應用奠定了理論基礎(chǔ)。但是所發(fā)現(xiàn)并報道的酶仍不能很好地滿足工業(yè)應用的要求，一部分原因在于相應基因信息的缺乏、過低的活性和較差的穩(wěn)定性。因此，迫切需要獲得具有全基因信息、高活性、高穩(wěn)定性的卡拉膠酶以在工業(yè)領(lǐng)域中得到全面的應用。