共培養(yǎng)過程中膠紅酵母對阿魏蘑產(chǎn)漆酶的影響及其發(fā)酵策略優(yōu)化

王寧寧，趙麗婷，李由然，顧正華，石貴陽，丁重陽

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

漆酶(EC 1.10.3.2)首次從日本漆樹(Rhusvenicifera)的汁液中被分離出來，屬于銅藍(lán)氧化蛋白酶家族的一員[1-3]，在造紙、污水脫毒與凈化、染料的降解、紡織工業(yè)、食品、藥品、生物傳感器、生物診斷及個(gè)人護(hù)理等領(lǐng)域都有大規(guī)模應(yīng)用[4-6]。自然界中生產(chǎn)漆酶的微生物大多為白腐真菌，但白腐真菌生產(chǎn)周期長以及漆酶產(chǎn)量低等因素限制了漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。

共培養(yǎng)作為一種環(huán)保、高效的生產(chǎn)技術(shù)可以顯著提高漆酶的產(chǎn)量[7-8]。在共培養(yǎng)過程中，微生物之間復(fù)雜的相互作用是影響產(chǎn)量的重要因素之一，由于微生物的生長活力和狀態(tài)不同，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量會受到不同的影響。如：Flores等[9]研究發(fā)現(xiàn)分別在P.ostreatus培養(yǎng)30和48 h時(shí)添加T.viride進(jìn)行共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶，前者的最高酶活比后者提高了56.58%；李愛華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，將不同培養(yǎng)時(shí)間的R.mucilaginos與S.cerevisiae共培養(yǎng)，最終糖苷酶的酶活也具有顯著差異，其中R.mucilaginos培養(yǎng)48 h后進(jìn)行共培養(yǎng)獲得的酶活最高；Rodíguez等[11]將FunaliafloccoseLPSC 232分別預(yù)培養(yǎng)3和6 d后與PenicilliumcommuneGHAIE 86進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)6 d的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組漆酶的酶活為預(yù)培養(yǎng)3 d共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組的2.73倍。

筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)過程中，膠紅酵母所產(chǎn)β-胡蘿卜素是共培養(yǎng)過程中促進(jìn)阿魏蘑產(chǎn)漆酶的關(guān)鍵因子[12-13]，并且在一定范圍內(nèi)，共培養(yǎng)的酶活隨共培養(yǎng)體系中β-胡蘿卜素含量的升高而升高[14]；通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，添加不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的膠紅酵母與阿魏蘑進(jìn)行共培養(yǎng)對漆酶的酶活有顯著的影響。因此，本文中，筆者通過對膠紅酵母的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期在進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)漆酶產(chǎn)量得到提高，在為共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化提供全新思路的同時(shí)，也為共培養(yǎng)過程中的微生物相互作用的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛肉膏、蛋白胨，Oxoid公司；2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，美國BBI公司；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SPARK型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UltiMate 3000型高效液相色譜，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20；pH自然。用于阿魏蘑菌種保藏與轉(zhuǎn)接。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20， 酵母膏10， 葡萄糖20；pH自然。用于膠紅酵母培養(yǎng)。

阿魏蘑種子培養(yǎng)基(g/L)：麩皮粉 10，玉米粉 10，葡萄糖 20，KH2PO43，MgSO4·7H2O 2；pH自然。用于阿魏蘑種子培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，玉米粉 10，麩皮粉 10，K2SO40.174 2；初始pH 9.0。用于阿魏蘑單培養(yǎng)與共培養(yǎng)的液態(tài)發(fā)酵。

1.2.2 培養(yǎng)方法

阿魏蘑種子培養(yǎng)：取2塊0.5 cm2大小的菌塊，接種于阿魏蘑種子培養(yǎng)基中，150 r/min、25 ℃培養(yǎng)168 h。

阿魏蘑單培養(yǎng)：向150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)3%的阿魏蘑種子液，150 r/min、25 ℃培養(yǎng)168 h。

膠紅酵母一級種子培養(yǎng)：用接種環(huán)劃取單菌落，接種于YPD培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h。

膠紅酵母二級種子培養(yǎng)：將一級種子以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃培養(yǎng)48 h。

阿魏蘑與膠紅酵母共培養(yǎng)：在阿魏蘑單培養(yǎng)48 h后，接入體積分?jǐn)?shù)6%的膠紅酵母二級種子液，繼續(xù)培養(yǎng)120 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖質(zhì)量濃度的優(yōu)化

設(shè)置YPD液體培養(yǎng)基的葡萄糖質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60和80 g/L，培養(yǎng)獲得的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)，測定各共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組的酶活，確定最優(yōu)葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.3.2 氮源的優(yōu)化

以YPD培養(yǎng)基中的含氮量為基準(zhǔn)，以相同含氮量的酵母粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、玉米漿作為氮源培養(yǎng)膠紅酵母，測定各共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組的酶活，確定最優(yōu)氮源；設(shè)定氮源質(zhì)量濃度為10、20、30、40和50 g/L，培養(yǎng)獲得的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)，測定各共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組的酶活，確定最優(yōu)氮源質(zhì)量濃度。

1.3.3 裝液量的優(yōu)化

將膠紅酵母培養(yǎng)基的裝液量分別設(shè)置為40、60、80、100和120 mL，測定各實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)產(chǎn)酶的情況，探究膠母培養(yǎng)基的裝液量對共培養(yǎng)酶活的影響。

1.3.4 初始pH的優(yōu)化

在上述實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)條件下，將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，測定各實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)產(chǎn)酶的情況，確定培養(yǎng)基的初始pH。

1.3.5 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

將膠紅酵母培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為20、25、30和35 ℃，測定各實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)的產(chǎn)酶情況，確定膠紅酵母最適培養(yǎng)溫度。

1.3.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

綜合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用Tukey′s多重比較檢驗(yàn)(P<0.05)進(jìn)行方差分析，選擇對共培養(yǎng)漆酶生產(chǎn)具有顯著性的影響因子，利用Design Expert 10.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析獲得最優(yōu)膠紅酵母培養(yǎng)工藝；以初始條件培養(yǎng)的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)作為對照，將最優(yōu)培養(yǎng)工藝獲得的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)，測定漆酶的產(chǎn)量。

1.4 酶活的測定方法

1)將發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min獲得上清液。

2)取適當(dāng)體積的上清液于沸水中5 min進(jìn)行滅活，將上清液和滅活后的酶液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。

3)將6 μL適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液加入264 μL 0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)的體系，置于酶標(biāo)儀中預(yù)熱至30 ℃。

4)預(yù)熱完成后，向上述體系中快速加入30 μL預(yù)熱至30 ℃的10 mmol/L ABTS溶液準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，以滅活后的酶液作為空白對照(A0)，測定420 nm處的吸光值(A1)。

漆酶的酶活定義：在上述反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，每分鐘氧化1 μmol ABTS所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

酶活按式(1)計(jì)算[15]。

(1)

式中：A1、A0分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組的吸光值；V為反應(yīng)體系的總體積(L)；V0為發(fā)酵液的體積(L)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；d為光程，此處為1 cm；ε為消光系數(shù)(mol-1·cm-1)，ABTS的ε420為36 000 mol-1·cm-l。

1.5 β-胡蘿卜素的提取和測定方法

1.5.1β-胡蘿卜素的提取

1)在10 000 r/min條件下離心5 min發(fā)酵后的酵母菌體，并用去離子水洗滌1次，凍干至恒質(zhì)量。

2)加入與發(fā)酵液等體積的3 mol/L鹽酸溶液，室溫浸泡40 min，沸水浴4 min，冰浴冷卻，10 000 r/min、10 min除去鹽酸溶液。

3)加入與發(fā)酵液相等體積的丙酮溶液，室溫萃取30 min，間或振蕩搖勻。

4)10 000 r/min離心10 min后收集上清液，于減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45 ℃、40 r/min條件下將丙酮蒸出，用1 mL的正己烷收集蒸餾燒瓶中的沉淀，在10 000 r/min、5 min條件下收集正己烷溶液。

1.5.2β-胡蘿卜素的測定

準(zhǔn)確稱取10 mg的β-胡蘿卜素標(biāo)品，溶解于正己烷溶液中，并定容至100 mL，制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，將標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

測定各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，擬合出β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計(jì)算待測樣品中β-胡蘿卜素的濃度[16]。

采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm)分離；Waters Acquity UC檢測器檢測，波長450 nm；流動相：純乙腈；柱溫45 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠紅酵母培養(yǎng)基葡萄糖質(zhì)量濃度對共培養(yǎng)酶活的影響

葡萄糖幾乎是所有微生物都適用且優(yōu)先選擇的碳源[18]，因此以葡萄糖為碳源進(jìn)行研究。設(shè)定膠紅酵母培養(yǎng)基中不同的葡萄糖濃度，測定培養(yǎng)獲得的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)的酶活，結(jié)果如圖1所示。

不同字母表示組間顯著性差異(P<0.05)，下同圖1 膠紅酵母培養(yǎng)基的葡萄糖質(zhì)量濃度對共培養(yǎng)漆酶酶活的影響Fig.1 Effects of glucose concentration of R. mucilaginosa medium on co-cultivation laccase activities

由圖1可知：隨著膠紅酵母培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，所培養(yǎng)后的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以20 g/L葡萄糖培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活最高，顯著高于其他濃度所獲得的酶活。

不同葡萄糖質(zhì)量濃度對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖2所示。由圖2可知：過低濃度的葡萄糖培養(yǎng)膠紅酵母時(shí)，碳源主要用于生長而無法積累過多的β-胡蘿卜素用以促進(jìn)共培養(yǎng)生產(chǎn)漆酶；過高濃度的葡萄糖培養(yǎng)膠紅酵母時(shí)，高滲環(huán)境下會抑制膠紅酵母正常的生長代謝，導(dǎo)致β-胡蘿卜素的產(chǎn)量較低，同樣不利于共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶。這進(jìn)一步說明葡萄糖對于微生物生長代謝的重要性。因此選定20 g/L葡萄糖進(jìn)行膠紅酵母的培養(yǎng)。

圖2 不同葡萄糖濃度對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different glucose concentrations on the growth of R. mucilaginosa and β-carotene production

2.2 膠紅酵母培養(yǎng)基氮源對共培養(yǎng)酶活的影響

以初始YPD培養(yǎng)基的含氮量作為基準(zhǔn)，選取5種常見的氮源(包括復(fù)合氮、有機(jī)氮和無機(jī)氮)，研究培養(yǎng)膠紅酵母的氮源種類對共培養(yǎng)酶活的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：以單一的酵母粉作為氮源培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活最高，這可能是由于酵母粉中含有大量膠紅酵母生長所需的前體物質(zhì)，更適于膠紅酵母的生長代謝，雖然YPD培養(yǎng)基中也含有酵母粉，但其濃度較低。因此選取酵母粉作為氮源培養(yǎng)膠紅酵母。

在確定酵母粉為膠紅酵母培養(yǎng)基的最適氮源后，進(jìn)一步對酵母粉的最適濃度進(jìn)行探究，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：隨著膠紅酵母培養(yǎng)基中酵母粉濃度的升高，所培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以30 g/L酵母粉培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活最高，顯著高于其他濃度所獲得的酶活。圖5為不同酵母粉質(zhì)量濃度對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。由圖5可知：過低濃度的酵母粉培養(yǎng)膠紅酵母時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)主要應(yīng)用于生長而無法積累過多的β-胡蘿卜素以促進(jìn)共培養(yǎng)漆酶生產(chǎn)；但隨著酵母粉濃度的增高，同樣不利于膠紅酵母的生長代謝，從而使得共培養(yǎng)的酶活沒有達(dá)到最高水平。因此選定30 g/L酵母粉進(jìn)行膠紅酵母的培養(yǎng)。

圖3 不同氮源培養(yǎng)的膠紅酵母對共培養(yǎng)漆酶酶活的影響Fig.3 Effects of R. mucilaginosa cultured with different nitrogen sources on co-culture laccase activity

圖4 膠紅酵母培養(yǎng)基的酵母粉質(zhì)量濃度對共培養(yǎng)漆酶酶活的影響Fig.4 Effects of yeast extract concentration on R. mucilaginosa medium on co-cultivation laccase activities

綜上所述，以20 g/L葡萄糖、30 g/L酵母粉作為膠紅酵母的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)48 h的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)獲得的漆酶的酶活較對照組提高了9.5%。

圖5 不同酵母粉質(zhì)量濃度對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different yeast extract concentrations on the growth of R. mucilaginosa and β-carotene production

2.3 膠紅酵母培養(yǎng)基的裝液量對膠紅酵母和共培養(yǎng)酶活的影響

O2對微生物的生長與產(chǎn)物的代謝至關(guān)重要[19]，裝液量會直接影響發(fā)酵液的溶氧。因此以不同裝液量培養(yǎng)的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)，探究膠紅酵母培養(yǎng)基的裝液量對共培養(yǎng)酶活的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知：隨著膠紅酵母培養(yǎng)基裝液量的升高，所培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活也出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以80 mL裝液量培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活最高，高于其他濃度所獲得的酶活。

圖7為不同裝液量對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。由圖7可知：當(dāng)裝液量為40 mL時(shí)，溶氧充足，膠紅酵母快速生長，獲得較高的生物量，但較低的營養(yǎng)物質(zhì)總量僅夠維持微生物的生長而無法進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的大量積累，因而β-胡蘿卜素的產(chǎn)量較低，從而使得與阿魏蘑進(jìn)行共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶時(shí)總酶活并不高。Han等[20]研究鎖擲酵母SporidioboluspararoseusJD-2產(chǎn)β-胡蘿卜素時(shí)發(fā)現(xiàn)，低溶解氧更有利于β-胡蘿卜素的積累，因而當(dāng)裝液量為100 mL甚至更高時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量比裝液量為40 mL時(shí)更高，但由于溶解氧濃度不足導(dǎo)致微生物生長緩慢，從而導(dǎo)致與阿魏蘑共培養(yǎng)的酶活也不高。因此選定裝液量為80 mL。

圖6 膠紅酵母培養(yǎng)基的裝液量對共培養(yǎng)漆酶酶活的影響Fig.6 Effects of R. mucilaginosa medium volume on the co-culture laccase activity

圖7 不同裝液量對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different medium volume on the growth of R. mucilaginosa and β-carotene production

2.4 膠紅酵母培養(yǎng)基初始pH對共培養(yǎng)酶活的影響

培養(yǎng)環(huán)境的pH同樣影響著微生物的生長與代謝[21]，通過設(shè)定膠紅酵母培養(yǎng)基的不同初始pH探究其對共培養(yǎng)酶活的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：在一定范圍內(nèi)，共培養(yǎng)的酶活隨膠紅酵母培養(yǎng)基初始pH的升高而升高，在初始pH為9.0的條件下培養(yǎng)獲得的膠紅酵母更有利于共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶。

圖8 不同初始pH培養(yǎng)的膠紅酵母對共培養(yǎng)漆酶酶活的影響Fig.8 Effects of R. mucilaginosa cultured at different initial pH on co-culture laccase activity

圖9為不同初始pH對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。由圖9可知：以9.0的初始pH將膠紅酵母培養(yǎng)48 h時(shí)，膠紅酵母的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，從而與阿魏蘑共培養(yǎng)后共培養(yǎng)酶活也最高；而當(dāng)初始pH達(dá)到10.0時(shí)，由于堿性較強(qiáng)的環(huán)境對膠紅酵母的生長代謝產(chǎn)生消極的影響，導(dǎo)致共培養(yǎng)的酶活有所降低。因此，選擇膠紅酵母培養(yǎng)基的初始pH為9.0。

圖9 不同初始pH對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of different initial pH on the growth of R. mucilaginosa and β-carotene production

2.5 膠紅酵母培養(yǎng)溫度對共培養(yǎng)酶活的影響

培養(yǎng)環(huán)境的溫度會影響微生物的生長和產(chǎn)物的代謝[22]，通過設(shè)定膠紅酵母的不同培養(yǎng)溫度，探究其對共培養(yǎng)酶活的影響，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知：以25 ℃培養(yǎng)的膠紅酵母添加到共培養(yǎng)體系后酶活最高。一般來說，紅酵母的培養(yǎng)溫度大多為25～30 ℃[23-27]。

圖10 不同溫度培養(yǎng)的膠紅酵母對共培養(yǎng)漆酶酶活的影響Fig.10 Effects of R. mucilaginosa cultured temperatures on co-culture laccase activity

圖11為不同溫度對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。由圖11可知：當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，溫度相對較低，膠紅酵母的生長代謝相對緩慢，從而導(dǎo)致共培養(yǎng)的酶活有所降低；當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，溫度相對較高，不利于β-胡蘿卜素的生產(chǎn)，導(dǎo)致共培養(yǎng)的酶活有所降低；當(dāng)培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，較高的溫度對膠紅酵母的生長代謝已經(jīng)產(chǎn)生了抑制作用，共培養(yǎng)的酶活也較低。史馨怡等[28]研究紅酵母Rhodotorulasp.產(chǎn)類胡蘿卜素時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)相對較低的溫度會促進(jìn)類胡蘿卜素的生產(chǎn)。因此選定25 ℃為膠紅酵母的培養(yǎng)溫度。

綜上所述，通過單因素實(shí)驗(yàn)得到膠紅酵母的最適培養(yǎng)條件為葡萄糖20 g/L、酵母粉30 g/L、初始pH 9.0、裝液量80 mL、培養(yǎng)溫度25 ℃。將上述條件下培養(yǎng)48 h的膠紅酵母與阿魏蘑進(jìn)行共培養(yǎng)，總酶活比對照組提高了34.13%。

2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

對單因素實(shí)驗(yàn)中的各因素進(jìn)行方差分析(ANOVA)，結(jié)果見表1。由表1可知：除裝液量這一因素外，其余因素的P值均小于0.05，說明這些因素在大于95%的概率水平下是顯著的。

圖11 不同溫度對膠紅酵母生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.11 Effects of different temperature on the growth of R. mucilaginosa and β-carotene production

根據(jù)方差分析的結(jié)果，對葡萄糖質(zhì)量濃度(A)、酵母粉質(zhì)量濃度(B)、初始pH(C)、培養(yǎng)溫度(D)這4個(gè)因素利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)產(chǎn)酶條件共培養(yǎng)漆酶酶活(LAC)。利用Design Expert 10.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)水平的設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用軟件Design Expert 10.0經(jīng)過回歸擬合所得的二次多項(xiàng)式為

LAC=2486.05-89.68A+156.56B+331.7C+247.28D-272.93AB+142.9AC-297.7AD+95.99BC+234.22BD+13.3CD-614.14A2-224.78B2-179.29C2-29.99D2。

通過對模型的方差分析(表4)可知，模型的P值小于0.01，表明模型二次方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.176 8)，一次項(xiàng)C、D極顯著，B顯著；二次項(xiàng)A2極顯著，AB、AD、BC、BD、B2、C2顯著，回歸方程決定系數(shù)R2為0.952 9，說明該回歸方程能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用其確定膠紅酵母最佳培養(yǎng)工藝[29]。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)方差分析

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平的編碼

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 響應(yīng)面方差分析表

圖12～14為不同因素的交互影響響應(yīng)面圖。當(dāng)初始pH和溫度位于最佳值9.8和28.5 ℃時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度和酵母粉質(zhì)量濃度對共培養(yǎng)漆酶產(chǎn)量的交互影響效應(yīng)顯著(圖12)。當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度和初始pH分別為38.5 g/L和9.8時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度對共培養(yǎng)酶活的交互作用顯著(圖13)，葡萄糖質(zhì)量濃度在較低水平時(shí)，共培養(yǎng)酶活在一定培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)隨著溫培養(yǎng)度的升高而升高，說明溫度對膠紅酵母的β-胡蘿卜素的產(chǎn)量影響較大。酵母粉質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度的交互影響作用見圖14，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度分別為38.5 g/L和28.5 ℃時(shí)，共培養(yǎng)酶活最高。

圖12 葡萄糖質(zhì)量濃度與酵母粉質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface diagram of the interaction between glucose concentration and yeast extract concentration

圖13 葡萄糖質(zhì)量濃度與溫度交互影響的響應(yīng)面圖Fig.13 Response surface diagram of the interaction between glucose concentration and temperature

圖14 溫度與酵母粉質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖Fig.14 Response surface diagram of the interaction between temperature and yeast extract concentration

對回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，結(jié)合圖12、13和14求得該模型的因變量LAC最大時(shí)對應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度、初始pH、培養(yǎng)溫度分別為18.82 g/L、38.5 g/L、9.8、28.5 ℃，最大響應(yīng)值(理論共培養(yǎng)漆酶酶活)為3 073.01 U/L?？紤]到實(shí)際的實(shí)驗(yàn)操作，以20 g/L的葡萄糖、38 g/L的酵母粉、初始pH 10.0、裝液量80 mL、28 ℃的條件培養(yǎng)48 h后，膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，共進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均值為2 983.64 U/L，理論值與實(shí)際值的相對偏差為2.99%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化共培養(yǎng)漆酶的產(chǎn)量是可行的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[30]。通過對膠紅酵母培養(yǎng)工藝的優(yōu)化使得最高共培養(yǎng)酶活比對照組(以初始工藝培養(yǎng)的膠紅酵母與阿魏蘑共培養(yǎng))提高了50.19%，且將發(fā)酵周期縮短了24 h，實(shí)現(xiàn)了漆酶產(chǎn)量的提高和生產(chǎn)成本的降低。

3 結(jié)論與展望

漆酶在環(huán)境保護(hù)、造紙、紡織工業(yè)、食品、藥品等諸多領(lǐng)域都有大規(guī)模應(yīng)用，本文以膠紅酵母培養(yǎng)條件為研究對象，得到最適于共培養(yǎng)的膠紅酵母培養(yǎng)條件，以20 g/L的葡萄糖、38 g/L的酵母粉、初始pH 10.0、裝液量80 mL、28 ℃的條件培養(yǎng)48 h后與阿魏蘑進(jìn)行共培養(yǎng)，最高共培養(yǎng)酶活比對照組提高了50.19%，且將發(fā)酵周期縮短了24 h，在提高漆酶產(chǎn)量的同時(shí)降低了生產(chǎn)成本。本研究不僅為共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶工藝優(yōu)化提供新的研究方向，還為其他共培養(yǎng)體系提供了新的參考策略。后續(xù)還可以將最優(yōu)工藝下培養(yǎng)的膠紅酵母與其他產(chǎn)漆酶的真菌菌株共培養(yǎng)，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。