巖藻多糖對免疫低下小鼠模型免疫功能和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

黃 娟，黃金莉，孫佳悅，李 瑤，李華軍*

（1 大連醫(yī)科大學(xué)微生態(tài)學(xué)教研室 遼寧大連 116044 2 大連海寶生物技術(shù)有限公司 遼寧大連 116044）

海藻是海帶、紫菜、裙帶菜等海洋藻類的總稱，富含蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，食藥兩用，以食為主，是一種理想的天然海洋食品[1]。巖藻多糖（Fucoidan，F(xiàn)UC）又名褐藻糖膠，是從海藻中提取出的一種水溶性多糖，主要由巖藻糖、硫酸鹽以及少量的甘露糖、半乳糖和糖醛酸組成[2]，具有抗炎，調(diào)節(jié)機體腸道菌群和免疫應(yīng)答等多種活性功能，常作為功能性食品應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域[3-4]。

腸道菌群是腸道中數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物群的總稱，參與食物的消化吸收與能量代謝[5]。正常情況下，腸道菌群與機體免疫系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持著腸道微生態(tài)的穩(wěn)定，對人體健康發(fā)揮著重要作用。當(dāng)菌群數(shù)量或種類發(fā)生顯著變化時，微生態(tài)平衡被打破，機體代謝紊亂、免疫失調(diào)，促使炎癥以及相關(guān)代謝和免疫類疾病的發(fā)生[6]。腸道菌群的構(gòu)成不僅與個體基因和環(huán)境因素有關(guān)，還與日常飲食密切相關(guān)。長期食用“不健康”食物（例如過量的紅肉）會導(dǎo)致腸道中有害菌的數(shù)量大大增加[7]，而增加膳食纖維的攝入可抑制腸道中有害菌的繁殖并能增加有益菌的種類和數(shù)量[8]。

目前，對巖藻多糖的研究多集中在成分結(jié)構(gòu)、提取工藝以及單一的抗炎抗氧化作用等方面，而對其作為功能食品對腸道菌群的影響以及對機體免疫的調(diào)節(jié)作用鮮有報道。環(huán)磷酰胺是臨床常見的抗腫瘤藥和免疫抑制劑，它可以抑制免疫球蛋白以及相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生[9]，并對腸道產(chǎn)生一定的損傷[10]。本文以BABL/C 小鼠為實驗動物，給小鼠注射環(huán)磷酰胺，構(gòu)建免疫低下模型。同時，灌胃給予免疫低下模型小鼠不同劑量的巖藻多糖水溶液。通過腸道菌群基因高通量測序技術(shù)，結(jié)合小鼠血清和組織中多種指標(biāo)的變化，從腸道微生物的角度，揭示巖藻多糖對免疫低下小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

巖藻多糖（裙帶菜來源），大連海寶生物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；ELISA 試劑盒，江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；Stool DNA Isolation Kit，成都福際生物技術(shù)有限公司；流式免疫熒光抗體，博奧森生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛，北京索萊寶科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 主要儀器

MAXI-MIX II 渦旋混勻器、MULTIFUGE X1R 低溫高速冷凍離心機、MULTSKAN FC 酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；光學(xué)顯微鏡CX43，日本Olympus 公司；流式細胞儀Calibur，美國BD 公司。

1.3 實驗動物及飼料

雄性SPF 級BABL/C 小鼠【6～7 周齡，平均體質(zhì)量（22±2）g】。實驗動物及小鼠基礎(chǔ)飼料，均購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物模型建立與分組 實驗小鼠在適應(yīng)實驗室環(huán)境一周后，隨機分為4 組（每組10 只）。從實驗第1 天開始，每組小鼠每天灌胃給與相應(yīng)溶液（不同添加量的巖藻多糖水溶液或生理鹽水），連續(xù)28 d；從第25 天開始，連續(xù)4 d 給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（正常組除外），具體分組見表1。

表1 實驗動物分組Table 1 Group of experimental mouse

1.4.2 體質(zhì)量與臟器指數(shù)檢測 實驗灌胃開始前一天晚上，給各組小鼠禁食12 h 后稱量每組小鼠空腹體質(zhì)量，計為初始體質(zhì)量；最后一次灌胃結(jié)束后當(dāng)晚給小鼠禁食12 h，第2 天稱量各組小鼠空腹體質(zhì)量，計為最終體質(zhì)量。之后，處死小鼠進行組織取材與稱重。依據(jù)公式：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)進行計算與分析。

1.4.3 免疫指標(biāo)檢測

1.4.3.1 脾臟組織病理學(xué)分析 取新鮮的小鼠脾臟組織，在4%多聚甲醛溶液中，浸泡過夜。次日，對脾臟組織進行石蠟包埋、連續(xù)切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色、中性樹膠封片等試驗操作。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3.2 脾臟T 淋巴細胞分析 取新鮮脾臟研磨成細胞懸液，鏡下計數(shù)細胞后洗滌細胞，用APC偶聯(lián)的抗小鼠CD3 抗體標(biāo)記脾臟細胞表面抗原，經(jīng)孵育洗滌后上機檢測，用Novo Express 軟件對結(jié)果進行分析。

1.4.3.3 血清免疫球蛋白、細胞因子及內(nèi)毒素含量檢測 所有動物在最后一次灌胃操作后，禁食12 h。次日，對小鼠進行摘取眼球采血。所有血樣在室溫下靜置60 min，以3 000 r/min 的速度，在低溫離心機內(nèi)離心15 min。后吸取上層淡黃色血清，分裝至小試管內(nèi)。按照試劑盒說明書步驟，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 （Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 檢測上清中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），干擾素（IFN）-γ，腫瘤壞死因子（TNF）-α，白介素（IL）-4，免疫球蛋白（Ig）M 和IgG 的質(zhì)量濃度。

1.4.4 回腸組織病理學(xué)分析 取新鮮的小鼠回腸組織，在4%多聚甲醛溶液中，浸泡過夜。次日，對回腸組織進行石蠟包埋、切片、脫蠟、染色、封片等試驗操作。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5 腸道菌群分析 試驗結(jié)束時，在超凈臺內(nèi)無菌收集各組小鼠盲腸內(nèi)容物，放于-80 ℃冰箱保存待用；之后用試劑盒提取小鼠盲腸內(nèi)容物DNA，進行腸道菌群16S rRNA 基因高通量測序，分析腸道菌群的物種組成以及在門水平與屬水平上的變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

SPSS 22.0 軟件被用來分析試驗數(shù)據(jù)，多組間在統(tǒng)計學(xué)上的比較，采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巖藻多糖對小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

與正常對照組（N）相比較，免疫低下模型組（M）小鼠的體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著下降（P<0.05）（表2），表明環(huán)磷酰胺對小鼠免疫造成了嚴(yán)重損害，成功構(gòu)建了小鼠免疫低下模型；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，高劑量（FHM）和低劑量巖藻多糖干預(yù)組（FLM）小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與M 組相比均顯著上升（P<0.05）（表2），表明巖藻多糖的干預(yù)有效緩解了環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠臟器指數(shù)的降低。

表2 巖藻多糖對小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of fucoidan on body weight and organ index in mice

2.2 巖藻多糖對小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠脾臟組織切片（圖1），N 組小鼠脾細胞排列緊密有序，細胞核清晰可見；M 組小鼠脾細胞數(shù)量明顯減少，細胞大小不一、排列稀疏無序；與M 組相比較，F(xiàn)UC 干預(yù)后，F(xiàn)LM 和FHM 組小鼠脾細胞數(shù)量顯著增加，細胞排列整齊，核仁清晰，少間隙，與N 組趨近。

圖1 小鼠脾臟組織形態(tài)Fig.1 Histomorphology of the spleen tissue in mice

2.3 巖藻多糖對小鼠脾臟T 淋巴細胞的影響

流式細胞術(shù)分析結(jié)果（圖2）顯示，與正常對照組（N）相比較，免疫低下模型組（M） CD3+淋巴細胞的表達量大大增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，CD3+淋巴細胞數(shù)量有下降趨勢，且FHM 組與M 組相比顯示出明顯差異（P<0.05），說明巖藻多糖的干預(yù)可下調(diào)CD3+淋巴細胞的過度表達。

圖2 巖藻多糖對小鼠脾臟CD3+ T 淋巴細胞的影響Fig.2 Effects of FUC on CD3+ T lymphocytes level in mice spleen

2.4 巖藻多糖對小鼠血清中免疫球蛋白、細胞因子以及炎癥因子的影響

ELISA 結(jié)果 （圖3） 顯示，M 組小鼠血清中l(wèi)gM、lgG、IL-4、IFN-γ 水平相較于N 組均明顯降低，而TNF-α 和LPS 水平顯著升高（P<0.05）；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，F(xiàn)LM、FHM 組血清中l(wèi)gM、lgG、IL-4、IFN-γ 水平顯著增高，TNF-α 和LPS 水平顯著下降（P<0.05），說明巖藻多糖可以有效緩解環(huán)磷酰胺對小鼠的免疫抑制，減輕炎癥，提高免疫低下小鼠的免疫功能。

圖3 巖藻多糖對小鼠血清中l(wèi)gG、lgM、IL-4、IFN-γ、TNF-α、LPS 的影響Fig.3 Effects of FUC on lgG，lgM，IL-4，IFN-γ，TNF-α，LPS content in mice serum

2.5 巖藻多糖對小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠回腸組織切片 （圖4），N 組小鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)完好，腸絨毛完整輪廓清晰可見，排列緊密；與N 組相比，M 組小鼠腸壁損傷、腸絨毛結(jié)構(gòu)被破壞、排列疏松、絨毛高度及隱窩深度均減少；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，F(xiàn)LM 和FHM 組小鼠腸絨毛形態(tài)逐漸恢復(fù)柵欄樣，且絨毛結(jié)構(gòu)清晰、長度增加，排列緊密。說明巖藻多糖在一定程度上緩解了環(huán)磷酰胺對腸黏膜的損害，保護了腸黏膜的完整。

圖4 小鼠回腸組織形態(tài)Fig.4 Histomorphology of the ileum tissue in mice

2.6 巖藻多糖對小鼠腸道菌群的影響

2.6.1 腸道菌群Alpha 多樣性分析 表3反映了各組小鼠腸道菌群在屬水平上的物種豐富度和微生物多樣性，與N 組相比，M 組Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)均沒有顯發(fā)生著變化；FLM 和FHM 組的Shannon 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao 指數(shù)與M 組相比也沒有差異，說明巖藻多糖干預(yù)對小鼠腸道菌群豐富度與物種多樣性沒有明顯影響。

表3 腸道菌群Alpha 多樣性Table 3 Alpha diversity of intestinal flora

2.6.2 腸道菌群Beta 多樣性分析 為研究各組小鼠腸道菌群的相似性和差異關(guān)系，根據(jù)Beta 多樣性距離矩陣對各組樣本在屬水平進行層級聚類分析（圖5a），結(jié)果顯示M 組被聚為一大類，N 組和FLM 與FHM 組被聚為一大類，說明M 組與N組腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的差異性較大，在經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后縮小了該差異，使得FLM 和FHM 組的群落結(jié)構(gòu)向N 組趨近，與N 組間差異??；PCA（圖5b）、PCoA（圖5c）、NMDS（圖5d）分析顯示，N 組和FHM 組距離相近，M 組和FLM 組距離相近，說明FHM 組的腸道菌群組成成分與N 組更相似，F(xiàn)LM 組與M 組更相似，也就是說高劑量的巖藻多糖對紊亂的腸道菌群的恢復(fù)作用更好。

圖5 腸道菌群Beta 多樣性Fig.5 Beta diversity of intestinal flora

2.6.3 腸道菌群物種組成與差異性分析 在門水平上（圖6），與N 組比，M 組的厚壁菌門（Firmicutes） 水平顯著降低 （P<0.05），擬桿菌門（Bacteroidota）水平顯著升高（P<0.05）；與M 組比，F(xiàn)LM組和FHM 組的擬桿菌門水平顯著降低（P<0.05），厚壁菌門水平顯著升高（P<0.05）。

圖6 巖藻多糖對小鼠優(yōu)勢菌門相對豐度的影響Fig.6 Effect of FUC on relative abundance of dominant bacterial phyla in mice

在屬水平上（圖7），與N 組比，M 組的擬桿菌屬（Bacteroides）和副擬桿菌屬（Parabacteroides）水平顯著升高（P<0.05），而乳酸桿菌屬（Lactobacillu）和羅斯氏菌屬（Roseburia）水平顯著降低（P<0.05）；與M 組比，F(xiàn)LM 組、FHM 組的擬桿菌屬和副擬桿菌屬水平顯著降低（P<0.05），而乳酸桿菌屬和羅斯氏菌屬水平顯著升高，且FHM 組變化更為明顯。

圖7 巖藻多糖對小鼠優(yōu)勢菌門相對豐度的影響Fig.7 Effect of FUC on relative abundance of dominant bacterial genera in mice

3 討論與結(jié)論

長期以來，食品和營養(yǎng)一直被認(rèn)為是影響人們健康最重要的因素，飲食習(xí)慣與人類常見的疾病息息相關(guān)。最新研究表明，食物成分對機體各種免疫炎癥途徑的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，不健康的飲食會促使炎癥的發(fā)生，從而導(dǎo)致腸炎、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等疾病[11]。此外，食物中含有的多糖、膳食纖維等成分不能被人體直接消化利用，需要在結(jié)腸中經(jīng)由腸道微生物發(fā)酵為特定的產(chǎn)物后才能吸收[12]。也就是說，飲食結(jié)構(gòu)的改變影響著腸道菌群的種類和數(shù)量。大量的研究報道了巖藻多糖作為一種從海藻中提取的活性物質(zhì)在體外的免疫活性作用。在體外，巖藻多糖的刺激可增強巨噬細胞的吞噬作用和對抗原提呈加工的能力[13]，能激活免疫系統(tǒng)中的細胞毒性T 細胞[14]，并促進樹突狀細胞的成熟[15]。然而，巖藻多糖作為一種功能食品對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用與其免疫活性作用聯(lián)系的研究卻鮮有報道。本文以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠為模型，評價了巖藻多糖在提高機體免疫力和調(diào)節(jié)腸道菌群方面的功能。

脾臟富含B 細胞和漿細胞，是免疫細胞發(fā)生吞噬作用的主要場所，胸腺是T 淋巴細胞發(fā)育，分化和成熟的器官[16]，胸腺和脾臟的改變，能夠反映機體免疫功能的狀態(tài)。在本實驗中，免疫低下模型組小鼠的脾臟和胸腺組織發(fā)生嚴(yán)重萎縮，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與正常組相比顯著下降，脾臟細胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重被破壞。而巖藻多糖干預(yù)組的脾臟和胸腺損傷程度明顯減輕，表明巖藻多糖是一種有效的免疫增強劑，可以緩解環(huán)磷酰胺對免疫器官的損害。研究表明多糖可以通過促進IgM 和IgG 的產(chǎn)生來增強體液免疫反應(yīng)的特異性[17]。此外，還有研究指出巖藻多糖可通過調(diào)控輔助T 細胞 （T-help cell，Th）的比例，誘導(dǎo)Th17 細胞分化，抑制調(diào)節(jié)性T 細胞（Regulatory T-cell，Treg）分化，以及增強T、B 細胞的增殖來增強機體免疫[18]。免疫球蛋白（IgM、IgG），由B 細胞分泌，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于抗體，具有中和毒素的能力，可被補體激活形成級聯(lián)抗體-抗原復(fù)合物，在體液免疫中發(fā)揮起主要作用[19]。IFN-γ 由細胞毒性T 細胞、NK 細胞產(chǎn)生，可介導(dǎo)細胞免疫并促進Th1 細胞的分化和增殖[20]。IL-4 是由Th1、Th2、Treg 細胞和B 細胞產(chǎn)生的有效的抗炎因子[21]，參加B 細胞和T 細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫，可促進B 淋巴細胞增殖和相應(yīng)抗體的產(chǎn)生[22]。本研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖不僅可以恢復(fù)環(huán)磷酰胺降低的lgG 和lgM 的含量，同時也增加了血清中IL-4 和IFN-γ 的水平（與模型組相比），提示巖藻多糖不僅激活了B 淋巴細胞增強了體液免疫，還參與了細胞免疫，調(diào)節(jié)了T 淋巴細胞的分化，從而刺激細胞因子的分泌。

人的胃腸道黏膜表面有上千種不同的類型的微生物，隨著飲食、疾病、環(huán)境等因素的變化而改變[23]。相關(guān)研究[24-26]報道稱環(huán)磷酰胺不僅會抑制機體免疫，還會破壞腸黏膜屏障，引起炎癥，并使腸道菌群易位。本研究也有相似的結(jié)果：模型組小鼠腸道結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，血清炎癥因子LPS 和TNF-α含量較正常組大大增加，腸道中厚壁菌門數(shù)量顯著降低，擬桿菌門含量顯著升高。但據(jù)Shang 等[27]的報道，腸道內(nèi)大多數(shù)分解碳水化合物的細菌很可能不受環(huán)磷酰胺的影響，而是與食物中多糖的含量有關(guān)，服用巖藻多糖可以降低腸道內(nèi)大腸肝菌等有害菌的數(shù)量，增加或恢復(fù)乳酸桿菌的數(shù)量，表明多糖可以保護腸黏膜屏障并能通過刺激乳酸桿菌的生長來抑制腸道有害菌，從而降低了炎癥性疾病的風(fēng)險。在本研究中，門水平上，模型組厚壁菌門數(shù)量顯著降低，擬桿菌門、藍細菌門以及變形桿菌門數(shù)量顯著增加，具體到屬水平上即乳酸桿菌和羅斯氏菌數(shù)量顯著降低，擬桿菌和變形桿菌數(shù)量顯著升高；在巖藻多糖干預(yù)后，失調(diào)的菌群結(jié)構(gòu)得到很大程度上的恢復(fù)，特別是乳酸桿菌的數(shù)量得到大大的增加。與此同時，干預(yù)組的血清中LPS 和TNF-α 的含量也明顯下降，LPS 和TNF-α的高低反映機體的炎癥狀態(tài)[28]，這更加有力地說明了巖藻多糖可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增加有益菌的數(shù)量并減少有害菌的數(shù)量來緩解腸道炎癥。

綜上所述，巖藻多糖可通過增加免疫球蛋白和細胞因子的分泌，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而提高免疫低下小鼠的免疫功能，并能有效緩解環(huán)磷酰胺造成的免疫器官和腸黏膜損傷，作用機制可能與其對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。