防己與甘草在防己黃芪湯中配伍后3種成分的變化

翟康欣， 遆安航， 李思思， 魏 珊， 裴香萍， 張淑蓉*

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西鑫煜制藥有限公司，山西 晉中 030600)

《金匱要略》記載，防己黃芪湯由防己、黃芪、白術(shù)、甘草組成，配伍生姜、大棗煎服，具有益氣祛風(fēng)、健脾利水之功效，主治風(fēng)濕或風(fēng)水之表虛不固、脈浮身重、汗出惡風(fēng)[1]，現(xiàn)代藥理研究表明該方可用于治療關(guān)節(jié)炎癥、水腫、風(fēng)濕免疫、腎臟疾病、肺部疾病等[2]，方中防己主要含有粉防己堿、防己諾林堿等成分，甘草主要含有甘草酸等成分，兩者為酸堿對藥，配伍后可能會形成酸堿復(fù)合物沉淀[3]。本實(shí)驗(yàn)參考裴妙榮等[4-6]研究“大黃硝石湯”“四逆湯”“大黃附子湯”的方法，考察防己、甘草單味藥水煎液、防己-甘草對藥水煎過濾液、防己-甘草對藥水煎離心液、全方水煎過濾液、全方水煎離心液、乙醇回流提取液等不同配伍、提取方法處理后粉防己堿、防己諾林堿、甘草酸提取量的變化及酸堿復(fù)合物的形成，并考察了酸堿復(fù)合物在人工胃液、人工腸液中的解離情況，以期探求堿性藥防己與酸性藥甘草在防己黃芪湯中配伍的化學(xué)變化規(guī)律，從而為該方藥效物質(zhì)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)，配置Miliennum32色譜工作站(美國Waters公司)；電子天平(FA2104 型，上海第二分析儀器廠)；離心機(jī)(LD5210型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。防己、甘草、黃芪、白術(shù)均購自河北安國藥材市場，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品。防己諾林堿(批號110793-200605)、粉防己堿(110711-200708)、甘草酸銨(批號110731-200614)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同配伍提取液制備 按處方比例[防己-黃芪-甘草(蜜炙)-白術(shù)=4∶5∶2∶3][1]精密稱取防己、甘草單味藥，防己-甘草對藥，防己黃芪湯全方，第1次加10倍量水浸泡30 min后煎煮45 min，第2次加8倍量水后煎煮30 min，合并煎液，一部分提取液雙層紗布過濾，作為水煎過濾液；另一部分提取液3 000 r/min離心15 min，作為水煎離心液。精密稱取單味藥、對藥及全方，95%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量，第2次加8倍量，每次1 h，合并，作為乙醇提取液。另取黃芪、甘草、白術(shù)，同法制成缺防己的陰性樣品溶液；取防己、黃芪、白術(shù)，同法制成缺甘草的陰性樣品溶液。

2.2 防己生物堿提取量測定

2.2.1 色譜條件 依利特Hypersil BDS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.3%甲醇-二乙胺(73∶27)；體積流量1 mL/min；柱溫室溫；檢測波長242 nm，色譜圖見圖1。由此可知，防己諾林堿、粉防己堿均達(dá)到基線分離，陰性無干擾。

1.防己諾林堿 2. 粉防己堿圖1 防己諾林堿、粉防己堿HPLC色譜圖

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱定防己諾林堿、粉防己堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含兩者0.1、0.064 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密吸取“2.1”項(xiàng)下水煎過濾液與水煎離心液(相當(dāng)于1 g防己)，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12，等量乙醚萃取5次，合并萃取液，低溫回收，甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得；精密吸取“2.1”項(xiàng)下乙醇提取液(相當(dāng)于1 g防己)，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液6份，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得到方程分別為粉防己堿Y=1 947 266.5X-7 912.8(r=0.999 7)，在0.2～2.0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；防己諾林堿Y=1 672 714.2X-10 025.7(r=0.999 8)，在0.128～1.28 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。粉防己堿精密度、穩(wěn)定性(12 h)、重復(fù)性試驗(yàn)峰面積RSD分別為2.05%、2.90%、2.70%，平均加樣回收率為100.21%，RSD為2.53%；防己諾林堿三者峰面積RSD分別為2.25%、2.92%、2.29%，平均加樣回收率為102.5%，RSD為1.10%，均符合相關(guān)要求。

2.2.5 結(jié)果分析 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算提取量，結(jié)果見表1。由此可知，水煎煮提取液中防己生物堿提取量隨著防己單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化依次降低，離心后更明顯；過濾后防己-甘草對藥生物堿提取總量是防己單藥的81.1%，全方為47.8%；離心后防己-甘草對藥生物堿提取總量是防己單藥的56.7%，全方為35.7%；乙醇回流提取液中防己生物堿提取量與水煎過濾液的變化趨勢相反，即隨著防己單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化，提取量依次增高。

表1 粉防己堿、防己諾林堿提取量測定結(jié)果(n=3)

2.3 甘草酸提取量測定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相0.2 mol/L甲醇醋酸銨-冰醋酸(63∶37∶1)；體積流量1 mg/mL；柱溫室溫；檢測波長250 nm，色譜圖見圖2。由此可知，甘草酸與其他成分達(dá)到基線分離，陰性無干擾。

1.甘草酸圖2 甘草酸HPLC色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，“2.3.1”項(xiàng)下流動相定容至10 mL量瓶中，制成含該成分0.265 0 mg/mL(折合甘草酸為0.259 6 mg/mL)的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取“2.1”項(xiàng)下水煎過濾液、水煎離心液(相當(dāng)于1 g甘草)適量，濃縮至10 mL，“2.3.1”項(xiàng)下流動相定容至25 mL量瓶中，濾過，即得；精密吸取“2.1”項(xiàng)下乙醇提取液(相當(dāng)于1 g甘草)適量，蒸干，“2.3.1”項(xiàng)下流動相定容至25 mL量瓶中，濾過，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察 取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液6份，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得到方程分別為甘草酸Y=918 952.8X-11 106.4(r=0.999 6)，在0.259 6～3.894 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。甘草酸精密度、穩(wěn)定性(12 h)、重復(fù)性試驗(yàn)峰面積RSD分別為1.14%、2.84%、2.42%，平均加樣回收率為101.6%, RSD為1.72%，均符合相關(guān)要求。

2.3.5 結(jié)果分析 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算提取量，結(jié)果見表2。由此可知，水煎煮提取液中甘草酸提取量隨著甘草單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化依次降低，離心比過濾更明顯；過濾后防己-甘草對藥提取量是甘草單藥的67.1%，全方為39.5%；離心后防己-甘草對藥提取量是甘草單藥的53.5%，全方為29.9%；乙醇回流提取液中甘草酸提取量隨著甘草單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化也依次降低，但不如水煎過濾液明顯。

表2 甘草酸提取量測定結(jié)果(n=3)

2.4 水煎沉淀物在人工胃液、人工腸液中的溶解性 取“2.1”項(xiàng)下離心沉淀物，分別溶于15 mL人工胃液、腸液中，38 ℃水浴攪拌15 min，離心，精密吸取上清液5 mL，加入15 mL 95%乙醇，沉淀，濾過，濾液水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取上述對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.2.1”“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算提取量，結(jié)果見表3。由此可知，人工胃液、腸液中均檢測到粉防己堿、防己諾林堿、甘草酸，但人工胃液中三者提取量明顯低于人工腸液中，特別是防己黃芪湯全方。

表3 粉防己堿、防己諾林堿、甘草酸提取量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參考《中國藥典》及文獻(xiàn)[7-11]報(bào)道建立了不同配伍防己黃芪湯中防己生物堿、甘草酸含量的測定方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)該方法準(zhǔn)確快速，簡便易行。再分別采用水煎煮過濾、水煎煮離心、乙醇回流提取方法比較不同配伍的防己黃芪湯，發(fā)現(xiàn)堿性防己與酸性甘草在合煎時形成了酸堿復(fù)合物沉淀，導(dǎo)致提取量減損，全方提取量進(jìn)一步降低，說明方中黃芪、白術(shù)會促進(jìn)沉淀生成；水煎煮離心上清液中生物堿提取量低于水煎煮過濾液中，可能是離心處理使煎液沉淀物更完全沉淀所致；以甘草/防己單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方為順序，乙醇提取液中甘草酸提取量隨配伍變化依次降低，防己生物堿提取量隨配伍變化依次提高，表明酸堿對藥主要在水煎液中形成復(fù)合物沉淀，乙醇作為提取溶劑不宜酸堿性成分相互反應(yīng)，與段秀俊等[6]報(bào)道的結(jié)果相似，這也印證了甘草酸與生物堿在酸性環(huán)境下易析出沉淀，而調(diào)至堿性環(huán)境后則不易出現(xiàn)的前期報(bào)道[12]。另外人工胃液、人工腸液中防己-甘草水煎沉淀物溶解性的測定結(jié)果顯示，兩者均發(fā)現(xiàn)防己生物堿、甘草酸，表明配伍后生成的復(fù)合物沉淀依然可能會在胃液及腸液的作用下重新解離出有效成分，從而發(fā)揮藥效。

近年來，酸堿藥對配伍產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象越來越受到重視，研究者已對其結(jié)構(gòu)有所研究[13-16]。裴妙榮等[17]推斷，四逆湯中酸堿復(fù)合物的形成是由于甘草酸糖鏈第2個葡萄糖醛酸的羧基與烏頭堿中的氮原子締合生成離子締合物。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿性成分為防己生物堿，其結(jié)構(gòu)中的氮原子類似烏頭堿，均為叔胺結(jié)構(gòu)，推測它與甘草酸形成復(fù)合物結(jié)構(gòu)最可能類似烏頭堿，即甘草酸結(jié)構(gòu)中糖鏈第2個葡萄糖醛酸的羧基與防己生物堿的氮原子發(fā)生締合，生成離子締合物(圖3)。但由于甘草酸分子中有3個羧基，防己生物堿有2個叔氮原子，其反應(yīng)摩爾比存在多種可能，情況更復(fù)雜，有待今后進(jìn)一步分離沉淀，并用核磁等手段鑒定結(jié)構(gòu)。

圖3 甘草酸與防己生物堿水煎煮締合反應(yīng)圖