• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    江蘇省大豆上一種新粉虱傳病毒的分子鑒定及系統(tǒng)進化分析

    2022-06-12 19:03:30吉穎吳淑華崔曉艷涂麗琴高丹娜程兆榜周益軍陳新季英華郭青云
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:分子鑒定聚類分析大豆

    吉穎 吳淑華 崔曉艷 涂麗琴 高丹娜 程兆榜 周益軍 陳新 季英華 郭青云

    摘要:2019年在對江蘇大豆上病毒病進行調(diào)查時,發(fā)現(xiàn)徐州和淮安大豆田間出現(xiàn)一種表現(xiàn)葉片黃化、花葉癥狀的病毒病,為明確其伴隨病毒種類,對田間采集的70份疑似病樣進行分子檢測和鑒定,結(jié)果在利用香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)通用引物檢測時發(fā)現(xiàn),70份疑似病樣中有15份樣品擴增到800 bp左右的目的片段,序列測定后BLAST分析結(jié)果顯示,其與一種粉虱傳病毒——豇豆輕斑駁病毒CpMMV(cowpea mild mottle virus,CpMMV)的同源性最高,暗示了其可能是CpMMV的一個分離物。針對CpMMV編碼的CP基因設(shè)計特異性引物,檢測結(jié)果顯示15份陽性樣品均擴增到目的片段,對獲得的CP基因片段進行克隆測序,發(fā)現(xiàn)其序列全長867 bp,編碼分子量約為32ku的蛋白;序列聚類分析結(jié)果顯示,其與已報道的CpMMV分離物有較高的同源性,并聚類到同一個大的分支,其中與安徽、海南等地分離物相對近緣,聚在同一個小分支。這些結(jié)果表明江蘇大豆存在豇豆輕斑駁病毒的侵染危害,生產(chǎn)上需要密切關(guān)注。

    關(guān)鍵詞:大豆;豇豆輕斑駁病毒;分子鑒定;聚類分析;進化樹構(gòu)建

    中圖分類號: S435.651? 文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2022)10-0030-07

    大豆(Glycine max L.)作為一種重要的經(jīng)濟作物,既是最常見油料作物,也是食品、飼料等行業(yè)的主要植物蛋白來源,在世界各地均有種植[1]。隨著種植區(qū)域的擴張,大豆上病毒病的發(fā)生呈現(xiàn)多發(fā)常發(fā)態(tài)勢。據(jù)報道,在美國可侵染大豆的病毒有110種,在中國也有50多種[2],例如大豆花葉病毒(soybean mosaic virus,SMV)、花生輕型斑駁病毒(peanut mild mottle virus,PMMV)、大豆矮縮病毒(soybean dwarf virus,SbDV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、苜?;ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus,AMV)、豇豆輕斑駁病毒(cowpea mild mottle virus,CpMMV)等[3-5]。

    豇豆輕斑駁病毒(cowpea mild mottle virus,CpMMV)是一種煙粉虱傳播的植物病毒[6],有相關(guān)報道亦可種傳[7-8],可侵染豆科、茄科、藜科和葫蘆科等多種植物。CpMMV侵染寄主植物常引起葉片斑駁癥狀,有些作物葉片會伴有系統(tǒng)性斑點、畸形、褪綠甚至壞死等癥狀[8],嚴重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。1973年,Brunt 等首次報道加納豇豆上出現(xiàn)CpMMV的危害[8],隨后該病毒迅速蔓延,在巴西[9]、尼日利亞[10]、約旦[11]、泰國[12]、印度[13]、坦桑尼亞[14]、以色列[15]、蘇丹[16]、阿根廷[17]、伊朗[18]、波多黎各[19]、委內(nèi)瑞拉[20]、美國[21]、貝寧[22]、烏干達[23]、墨西哥[24]、肯尼亞[25]等多個國家和地區(qū)均有該病毒的報道。在中國,2013年Chang等首次報道臺灣豇豆和四季豆上存在CpMMV的侵染危害[26];2015年劉雪建利用小RNA深度測序及RT-PCR技術(shù)在江西四季豆上檢測到CpMMV[27];2019年,楊曉等報道海南豇豆上也出現(xiàn)CpMMV的危害[5];但目前CpMMV在大豆上僅安徽有危害報道[28]。

    CpMMV隸屬于蕪菁黃花葉病毒目(Tymovirales)乙型線狀病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)[29],其基因組是正單鏈RNA,長度約為8 200 bp,病毒粒子為彎曲的絲狀顆粒(約650 nm×15 nm),具有5′末端帽子結(jié)構(gòu)和3′末端Poly(A)尾,編碼6個蛋白:ORF1編碼復(fù)制酶蛋白,含4個保守的基序,即甲基轉(zhuǎn)移酶、C23肽酶、解旋酶和RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)[30-33];ORF2、ORF3和ORF4編碼病毒運動所必需的三重基因模塊(TGB1-3,大小分別為250、11.6、7.5 ku);ORF5編碼外殼蛋白(coat protein,CP,32 ku);ORF6編碼一個核酸結(jié)合蛋白(nucleic acid binding protein,NBP,15.2 ku)[34]。其中外殼蛋白是CpMMV重要的結(jié)構(gòu)蛋白,且能結(jié)合TGB1-3參與病毒胞間運動[35-36],在病毒分類上也是該屬一個重要的參考指標[37]。

    CpMMV在我國首次報道是2013年(中國臺灣地區(qū))[26],隨后江西、海南也出現(xiàn)該病毒發(fā)生危害的報道[5,27],而對于大豆,只在安徽有侵染危害報道[28]。2019年筆者在江蘇徐州和淮安的田間發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)疑似病毒感染的大豆病株,大豆病樣采集后經(jīng)分子檢測與鑒定,結(jié)果在大豆病樣中檢測到CpMMV,之后的序列分析結(jié)果也證實了這一結(jié)果,說明CpMMV在江蘇大豆上已存在危害。

    1 材料與方法

    1.1 供試病樣

    病樣為2019年采自江蘇省徐州市和淮安市疑似感染病毒病的大豆樣本,共70份,對照為網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)的健康大豆苗,樣本采集后用液氮處理,于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 病樣總RNA提取

    取在超低溫冰箱中的大豆樣品,液氮處理后置于研磨機中研磨至粉末,采取Trizol法[38]提取樣品總RNA,保存于-80℃冰箱備用。

    1.3 病樣RT-PCR檢測

    以病樣總RNA為模板,用PrimeScriptTM RT Master Mix進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應(yīng)體系(20 μL):病樣總RNA 1 μL,5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,用RNase-Free H2O補足至總體積20 μL。反應(yīng)程序:37 ℃恒溫15 min,85 ℃變性 5 s,4 ℃保存,獲得cDNA。對其進行PCR檢測,PCR反應(yīng)體系(10 μL):2×Taq Master Mix 5 μL,ddH2O 3 μL,Car_F2b和Car_R(表1)各0.5 μL,cDNA 1 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性 15 s,47 ℃退火15 s,72 ℃延伸55 s,32個循環(huán);72 ℃ 延伸6 min,4 ℃保存。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物在0.5 × TAE電泳緩沖液中,用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并拍照,將擴增出的與目的片段一致的產(chǎn)物送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序。

    1.4 CpMMV CP基因克隆

    依據(jù)CpMMV外殼蛋白序列設(shè)計一對特異引物CpMMCP_F和CpMMCP_R(表1),以檢測結(jié)果為陽性的cDNA為模板進行RT-PCR擴增。擴增體系(20 μL):2×Rapid Taq Master Mix 10 μL,CpMMCP_F和CpMMCP_R各 1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL;PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,51 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,循環(huán) 34 次;72 ℃ 5 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收純化目的片段,將其與pMD-18T載體在16 ℃下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞后涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。挑LB平板上的單克隆進行菌落PCR和酶切驗證,鑒定無誤后將菌液送通用生物系統(tǒng)(安徽)公司進行測序。

    1.5 序列測定及分析

    委托通用生物系統(tǒng)(安徽)公司完成測序。使用ClustalX、BioEdit、DNAstar、MEGA6等軟件及NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)完成聚類分析及進化樹構(gòu)建,進化樹的可信度使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制實現(xiàn)評價。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病害田間癥狀

    2019年,筆者在對江蘇大豆上病害進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)徐州和淮安大豆上存在疑似病毒侵染的病株,發(fā)病大豆植株田間主要表現(xiàn)葉片黃化、花葉等癥狀(圖1),病害田間多呈零星發(fā)生,個別田塊局部區(qū)域發(fā)病較重。

    2.2 香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)病毒檢測

    大豆上發(fā)生的病毒病多種多樣,對大豆病樣的RNA進行RT-PCR檢測能明確其感染的病毒種類,在利用Carlavirus通用引物Car_F2b和Car_R對大豆樣品進行檢測時發(fā)現(xiàn), 70份疑似病樣中有15份(徐州14份,淮安1份)擴增到與目的條帶(800 bp)大小相近的片段,而健康對照中沒有擴增到條帶(圖2),說明大豆病樣中可能有香石竹潛隱病毒屬病毒的感染。為明確病毒的種類,抽選5份樣品進行序列測定,序列BLAST分析結(jié)果顯示其與豇豆輕斑駁病毒(MN908944)同源性最高(9891%),說明在徐州和淮安采集的大豆樣品中可能存在著豇豆輕斑駁病毒的侵染。

    2.3 豇豆輕斑駁病毒的分子檢測

    為進一步驗證檢測到的病毒是CpMMV,筆者針對CpMMV的CP基因設(shè)計一對特異性擴增引物CPMMCP_F和CPMMCP_R,RT-PCR結(jié)果顯示,15份陽性樣品均擴增到了與目的條帶大?。?67 bp)相近的特異性條帶(圖3),即CpMMV的CP基因條帶,這進一步說明樣品中確有可能存在CpMMV的感染。

    2.4 豇豆輕斑駁病毒CP基因克隆及其序列分析

    隨機抽選3個樣品進行CP基因PCR擴增(圖4-a),經(jīng)單菌落PCR和酶切驗證(圖4-b)后送通用生物系統(tǒng)(安徽)公司進行測序。

    對獲取的6個CP基因克隆進行測序,結(jié)果顯示,序列全長都為867 bp,編碼一個由289個氨基酸組成的分子量約32 ku的蛋白。序列之間有很高的同源性,BLAST分析結(jié)果表明,它們與CpMMV(MT232837)同源性最高(99%),暗示了其屬于CpMMV的一個分離物。

    2.5 豇豆輕斑駁病毒CP基因系統(tǒng)進化分析

    使用ClustalX等軟件將本研究測定的CpMMV CP序列與已公開的其他CpMMV分離物CP基因序列(表2)進行比對,同時利用MEGA 6軟件,使用臨近法(neighbor-joining,NJ)、Kimura 2-parameter模型重建了系統(tǒng)進化樹(圖5),各個分枝的Bootstrap置信度用1 000次自導(dǎo)復(fù)制來評價。

    基于CP核苷酸序列重建的系統(tǒng)進化分析結(jié)果(圖5、表2)顯示,本研究測定的分離物在進化樹中全部聚類到CpMMV大分支中,說明檢測到的病毒為CpMMV的一個分離物;同時結(jié)果還顯示,江蘇分離物與我國的安徽大豆分離物、海南豇豆分離物、臺灣菜豆分離物(JX020701)、印尼大豆分離物及印度黑吉豆分離物(KJ534277)相對近緣共同聚類到一個分支,其中與安徽大豆分離物最為近緣,而與中國臺灣豇豆分離物(JX070669)及其他國外分離物相對遠緣,分別處在不同的分支上。這些分析結(jié)果進一步說明本研究在江蘇大豆上檢測到的病毒為CpMMV的一個分離物。

    3 討論

    江蘇省大豆栽植面積在25萬hm2左右,是我國重要的大豆產(chǎn)區(qū)之一[40]。近年來隨著各地經(jīng)貿(mào)往來(種苗調(diào)運)的頻繁和農(nóng)業(yè)種植模式的改變,加之傳播介體的大發(fā)生,大豆病毒病呈多發(fā)態(tài)勢,而大豆病毒病危害通常會導(dǎo)致10%~15%的產(chǎn)量損失,復(fù)合侵染往往會加重產(chǎn)量損失[21]。本研究對2019年采集于江蘇省徐州和淮安地區(qū)的大豆病樣進行檢測時,發(fā)現(xiàn)其中伴隨有病毒侵染,進一步通過基因克隆及序列分析等方法對其進行了鑒定,結(jié)果顯示,它屬于CpMMV的一個分離物,該病毒之前在我國臺灣(菜豆、四季豆)[26]、江西(四季豆)[27]、海南(豇豆)[5]和安徽(大豆)[28]有發(fā)生危害的報道,但江蘇尚未有發(fā)生危害的報道,因此本研究是CpMMV侵染江蘇大豆的第1個報道,同時CpMMV也是第1個侵染危害江蘇省大豆的粉虱傳病毒。

    CpMMV是我國近幾年來新發(fā)生的一種重要的粉虱傳播的植物病毒,能夠侵染豆科和茄科多種作物,目前已廣泛分布于亞洲、美洲和非洲[7-8,21],對包括大豆在內(nèi)的多種作物造成了嚴重的經(jīng)濟損失[8]。目前我國安徽、海南等地已經(jīng)出現(xiàn)CpMMV發(fā)生危害,本研究報道江蘇也有該病毒發(fā)生危害,但目前我國大豆對該病毒的抗性尚不明確,而該病毒可由煙粉虱傳播,且近幾年來病毒傳播介體煙粉虱的大發(fā)生,極有可能導(dǎo)致該病毒在更大范圍流行危害,因此生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)高度重視,密切關(guān)注該病毒的危害動態(tài),早發(fā)現(xiàn)、早防控,避免擴散蔓延至全國范圍造成更大的危害和損失。

    由于大豆上的病毒種類繁多,本研究中除了對CpMMV進行檢測外,同時也對其他大豆常見病毒如黃瓜花葉病毒、菜豆普通花葉病毒、大豆花葉病毒等進行了檢測,結(jié)果在這批樣品中也檢測到了菜豆普通花葉病毒等病毒,說明江蘇大豆上病毒種類相對比較復(fù)雜,要摸清江蘇大豆上的病毒種類還需后續(xù)更廣泛的樣品采集和更為系統(tǒng)的病毒種類調(diào)查。

    參考文獻:

    [1]趙團結(jié),蓋鈞鎰. 栽培大豆起源與演化研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,37(7):954-962.

    [2]智海劍. 大豆對大豆花葉病毒抗侵染和抗擴展特性的鑒定、遺傳和利用研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005:3.

    [3]單宇航,高維達,于 曼,等. 大豆花葉病毒沈陽分離物全基因測序及系統(tǒng)進化分析[J]. 中國植保導(dǎo)刊,2020,40(2):17-21.

    [4]Hobbs H A,Domier L L,Nelson B D. First report of alfalfa mosaic virus and soybean dwarf virus on soybean in North Dakota[J]. Plant Disease,2012,96(12):1829.

    [5]楊 曉,張 宇,陳 莎,等. 豇豆輕斑駁病毒海南分離物全基因組序列測定及分子特征[J]. 中國蔬菜,2019(6):35-38.

    [6]Muniyappa V,Reddy D V R. Transmission of cowpea mild mottle virus by Bemisia tabaci in a non-persistent manner[J]. Plant Disease,1983,67(4):391-393.

    [7]Iwaki M,Thongmeearkom P,Honda Y,et al. Cowpea mild mottle virus occurring on soybean and peanut in southeast Asian countries[J]. Technical Bulletin of the Tropical Agriculture Research Center,1986,21:106-120.

    [8]Brunt A A,Kenten R H. Cowpea mild mottle,a newly recognized virus infecting cowpeas (Vigna unguiculata) in Ghana[J]. Annals of Applied Biology,1973,74(1):67-74.

    [9]Zanardo L G,Silva F N,Bicalho A A C,et al. Molecular and biological characterization of cowpea mild mottle virus isolates infecting soybean in Brazil and evidence of recombination[J]. Plant Pathology,2014,63(2):456-465.

    [10]Brunt A A,Phillips S. ‘Fuzzy vein’,a disease of tomato (Lycopersicon esculentum) in western Nigeria induced by cowpea mild mottle virus[J]. Tropical Agriculture,1981,58(2):177-180.

    [11]Mansour A,Al-Musa A,Vetten H J,et al. Properties of a cowpea mild mottle virus (CPMMV) isolate from eggplant in Jordan and evidence for biological and serological differences between CPMMV isolates from leguminons and solanaceous hosts[J]. Journal of Phytopathology,1998,146(11/12):539-547.

    [12]Iwaki M,Thongmeearkom P,Honda Y,et al. Whitefly transmission and some properties of cowpea mild mottle virus on soybean in Thailand[J]. Plant Disease,1982,66(1):365-368.

    [13]Iizuka N R,Rajeshwari R,Reddy D V R,et al. Natural occurrence of a strain of cowpea mild mottle virus on groundnut (Arachis hypogaea) in India[J]. Journal of Phytopathology,1984,109(3):245-253.

    [14]Mink G I,Keswani C L. First report of cowpea mild mottle virus on bean and mung bean in Tanzania[J]. Plant Disease,1987,71(6):557.

    [15]Antignus Y,Cohen S. Purification and some properties of a new strain of cowpea mild mottle virus in Israel[J]. Annals of Applied Biology,1987,110(3):563-569.

    [16]El-Hassan S M,Naidu R A,Ahmed A H,et al. A serious disease of groundnut caused by cowpea mild mottle virus in the Sudan[J]. Journal of Phytopathology,1997,145(7):301-304.

    [17]Rodríguez Pardina P E,Arneodo J D,Truol G A,et al. First report of cowpea mild mottle virus in bean crops in Argentina[J]. Australasian Plant Pathology,2004,33(1):129-130.

    [18]Tavassoli M,Shahraeen N,Ghorbani S. Detection and some properties of cowpea mild mottle virus isolated from soybean in Iran[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences,2008,11(23):2624-2628.

    [19]Brace R C,F(xiàn)ehr W R,Graham M A. Inheritance and molecular mapping of an allele providing resistance to a cowpea mild mottle-like virus in soybean[J]. Crop Science,2012,52(5):2109-2114.

    [20]Brito M,F(xiàn)ernández-Rodríguez T,Garrido M J,et al. First report of cowpea mild mottle Carlavirus on yardlong bean (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis) in Venezuela[J]. Viruses,2012,4(12):3804-3811.

    [21]Rosario K,Capobianco H,Ng T F F,et al. RNA viral metagenome of whiteflies leads to the discovery and characterization of a whitefly-transmitted Carlavirus in North America[J]. PLoS One,2014,9(1):e86748.

    [22]Zinsou V A,Afouda L A C,Zoumarou-Wallis N,et al. Importance of cowpea mild mottle virus on soybean (Glycine max) in Benin and effect of planting date on soybean (G.max) virus level in northern Benin[J]. Crop Protection,2015,72:139-143.

    [23]Orawu M,Obuo J,Omadi R. Distribution and detection of cowpea viruses infecting cowpea in Uganda[J]. American Journal of Plant Sciences,2015,6(5):574-581.

    [24]Chiquito-Almanza E,Caballero-Pérez J,Guevara-Olvera L,et al. First report of cowpea mild mottle virus infecting cultivated and wild Phaseolus in the central-western region of Mexico[J]. Plant Disease,2018,102(5):1047.

    [25]Odhiambo Patrick O,Were H,Ndonga M,et al. First report of cowpea polero virus 1 (CPPV1) infecting cowpea in Kenya[J]. International Journal of Genetics and Genomics,2019,7(4):119-123.

    [26]Chang C A,Chien L Y,Tsai C F,et al. First report of cowpea mild mottle virus in cowpea and French bean in Taiwan[J]. Plant Disease,2013,97(7):1001.

    [27]劉雪建. 浙江省和江西省蔬菜病毒鑒定與變異研究[D]. 杭州:浙江大學(xué),2015:113-116.

    [28]Wei Z Y,Wu G W,Ye Z X,et al. First report of cowpea mild mottle virus infecting soybean in China[J]. Plant Disease,2020,104(9):2534.

    [29]King A. Virus taxonomy:ninth report of the international committee on taxonomy of viruses[M]. San Diego:Academic Press,2012:855-881.

    [30]Rozanov M N,Koonin E V,Gorbalenya A E. Conservation of the putative methyltransferase domain:a hallmark of the ‘Sindbis-like’ supergroup of positive-strand RNA viruses[J]. Journal of General Virology,1992,73(8):2129-2134.

    [31]Koonin E V. The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses[J]. Journal of General Virology,1991,72 ( Pt 9):2197-2206.

    [32]Lawrence D M,Rozanov M N,Hillman B I. Autocatalytic processing of the 223-kDa protein of blueberry scorch carlavirus by a papain-like proteinase[J]. Virology,1995,207(1):127-135.

    [33]Gorbalenya A E,Koonin E V. Viral proteins containing the purine NTP-binding sequence pattern[J]. Nucleic Acids Research,1989,17(21):8413-8438.

    [34]Zanardo L G,Carvalho C M. Cowpea mild mottle virus (Carlavirus,Betaflexiviridae):a review[J]. Tropical Plant Pathology,2017,42(6):417-430.

    [35]Wylie S J,Adams M,Chalam C,et al. ICTV virus taxonomy profile:Potyviridae[J]. Journal of General Virology,2017,98(3):352-354.

    [36]Lough T J,Netzler N E,Emerson S J,et al. Cell-to-cell movement of potexviruses:evidence for a ribonucleoprotein complex involving the coat protein and first triple gene block protein[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2000,13(9):962-974.

    [37]Adams M J,Antoniw J F,F(xiàn)auquet C M. Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae[J]. Archives of Virology,2005,150(3):459-479.

    [38]吳淑華,趙文浩,李廷芳,等. 南京辣椒上一種斑駁類型病毒病的分子鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,31(6):1284-1290.

    [39]Nie X Z,Bai Y J,Molen T A,et al. Development of universal primers for detection of potato carlaviruses by RT-PCR[J]. Journal of Virological Methods,2008,149(2):209-216.

    [40]陳 新,顧和平,張紅梅,等. 江蘇省大豆生產(chǎn)發(fā)展歷史、現(xiàn)狀與前景分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):6-9.

    猜你喜歡
    分子鑒定聚類分析大豆
    注意防治大豆點蜂緣蝽
    從大豆種植面積增長看我國糧食安全
    巴西大豆播種順利
    大豆的營養(yǎng)成分及其保健作用
    ITS2序列分析在白花蛇舌草鑒定中的應(yīng)用研究
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    食用菌真菌病害的分離鑒定與防治
    農(nóng)村居民家庭人均生活消費支出分析
    基于省會城市經(jīng)濟發(fā)展程度的實證分析
    中國市場(2016年33期)2016-10-18 12:16:58
    基于聚類分析的互聯(lián)網(wǎng)廣告投放研究
    科技視界(2016年20期)2016-09-29 12:32:48
    国产精品国产三级国产专区5o| 在线观看免费日韩欧美大片 | a级片在线免费高清观看视频| 十分钟在线观看高清视频www | 新久久久久国产一级毛片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产成人aa在线观看| 免费av不卡在线播放| 热re99久久国产66热| 色视频www国产| av网站免费在线观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产精品999| 国产精品一区二区在线不卡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av一本久久久久| 免费看不卡的av| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美性感艳星| 街头女战士在线观看网站| 欧美3d第一页| 日韩免费高清中文字幕av| 久久 成人 亚洲| 插阴视频在线观看视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产成人一精品久久久| 久热这里只有精品99| 国产男女超爽视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| av播播在线观看一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品三级大全| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 大片电影免费在线观看免费| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品欧美亚洲77777| 在线观看美女被高潮喷水网站| 青青草视频在线视频观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 日本黄大片高清| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av在线观看美女高潮| h日本视频在线播放| av播播在线观看一区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 美女视频免费永久观看网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 婷婷色综合大香蕉| av卡一久久| 九九爱精品视频在线观看| 黄色配什么色好看| 少妇人妻久久综合中文| 热99国产精品久久久久久7| 国产成人精品一,二区| 免费观看在线日韩| 精品午夜福利在线看| 一本大道久久a久久精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲成色77777| 3wmmmm亚洲av在线观看| 搡老乐熟女国产| 在线观看免费高清a一片| 久久久久视频综合| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲av.av天堂| 亚洲精品国产色婷婷电影| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产 精品1| 中文字幕免费在线视频6| 男人添女人高潮全过程视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品久久久久久久久av| 妹子高潮喷水视频| 国产高清不卡午夜福利| 日韩av免费高清视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产高清不卡午夜福利| 亚州av有码| 99久国产av精品国产电影| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品亚洲一区二区| 国精品久久久久久国模美| 国产91av在线免费观看| 两个人的视频大全免费| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 美女内射精品一级片tv| 中文字幕久久专区| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 91成人精品电影| 免费观看av网站的网址| 黑人猛操日本美女一级片| 在线免费观看不下载黄p国产| kizo精华| 国产成人91sexporn| 我要看黄色一级片免费的| 国产免费又黄又爽又色| 午夜av观看不卡| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 又爽又黄a免费视频| 国产av码专区亚洲av| 一级片'在线观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久久网色| 免费看光身美女| 精品一区二区免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 街头女战士在线观看网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 在线看a的网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久国产精品麻豆| 精品久久久久久久久亚洲| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日本黄大片高清| www.色视频.com| 91在线精品国自产拍蜜月| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99re6热这里在线精品视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩亚洲欧美综合| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲av男天堂| 97精品久久久久久久久久精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久影院123| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 永久免费av网站大全| 亚洲精品国产成人久久av| 嘟嘟电影网在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 欧美性感艳星| 伊人久久国产一区二区| 一区二区三区精品91| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品456在线播放app| 欧美成人午夜免费资源| 日韩免费高清中文字幕av| 韩国av在线不卡| 欧美97在线视频| 黄色配什么色好看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| kizo精华| 亚洲国产精品999| 久久久亚洲精品成人影院| www.色视频.com| 久久6这里有精品| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲第一av免费看| 色94色欧美一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲av.av天堂| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 视频区图区小说| 嫩草影院新地址| 欧美丝袜亚洲另类| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av.av天堂| 麻豆成人午夜福利视频| 少妇高潮的动态图| 国产亚洲欧美精品永久| 中文字幕制服av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费观看无遮挡的男女| 另类亚洲欧美激情| 精品午夜福利在线看| 婷婷色av中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品久久久精品久久久| 日本黄色日本黄色录像| 成人特级av手机在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 成人毛片60女人毛片免费| 午夜免费鲁丝| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 在线观看国产h片| 免费黄网站久久成人精品| 永久免费av网站大全| 日日爽夜夜爽网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 最近的中文字幕免费完整| 女性生殖器流出的白浆| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美精品国产亚洲| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 曰老女人黄片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品成人在线| 亚洲自偷自拍三级| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品色激情综合| 国产精品久久久久成人av| 晚上一个人看的免费电影| 精品久久久噜噜| 伊人亚洲综合成人网| 黄色毛片三级朝国网站 | 黄色配什么色好看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 六月丁香七月| 免费少妇av软件| 久久免费观看电影| 久久ye,这里只有精品| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇的逼好多水| 在线观看www视频免费| 免费大片黄手机在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产亚洲91精品色在线| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| av在线app专区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品酒店卫生间| 爱豆传媒免费全集在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美激情国产日韩精品一区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜免费鲁丝| 中文在线观看免费www的网站| 久久久亚洲精品成人影院| 视频中文字幕在线观看| 国产av码专区亚洲av| 国产一区亚洲一区在线观看| av女优亚洲男人天堂| 国产精品人妻久久久久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品国产国语对白av| 一级爰片在线观看| 午夜日本视频在线| 视频中文字幕在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av欧美aⅴ国产| av.在线天堂| 美女视频免费永久观看网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一本色道久久久久久精品综合| 久久99热6这里只有精品| 色网站视频免费| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费黄网站久久成人精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本av手机在线免费观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产黄色免费在线视频| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲无线观看免费| 色吧在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 高清黄色对白视频在线免费看 | 欧美97在线视频| 精品国产一区二区久久| 久久精品国产亚洲网站| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产淫语在线视频| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国内精品宾馆在线| 六月丁香七月| 99热这里只有是精品50| 久久99蜜桃精品久久| 国产av国产精品国产| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产69精品久久久久777片| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲精品日本国产第一区| 伦精品一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 麻豆乱淫一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久精品久久久久久久性| 交换朋友夫妻互换小说| 成年人午夜在线观看视频| 国产熟女欧美一区二区| 一本久久精品| 天堂中文最新版在线下载| 丰满少妇做爰视频| 插逼视频在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲成人av在线免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线精品无人区一区二区三| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日日啪夜夜爽| 亚洲av中文av极速乱| 免费高清在线观看视频在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av卡一久久| 人人妻人人看人人澡| 日韩制服骚丝袜av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费av不卡在线播放| 一级毛片电影观看| 国产深夜福利视频在线观看| 久久热精品热| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲三级黄色毛片| 只有这里有精品99| 超碰97精品在线观看| 只有这里有精品99| 丝袜在线中文字幕| 美女主播在线视频| 极品教师在线视频| 日本色播在线视频| 中文字幕免费在线视频6| 最黄视频免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 成人黄色视频免费在线看| 婷婷色av中文字幕| 视频区图区小说| 丝瓜视频免费看黄片| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国产精品.久久久| 黄色毛片三级朝国网站 | 久久久久网色| 久久久亚洲精品成人影院| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩欧美 国产精品| 欧美日韩av久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品一区www在线观看| 日韩欧美 国产精品| 国产精品99久久99久久久不卡 | 9色porny在线观看| 内射极品少妇av片p| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久久久精品精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜91福利影院| 熟女电影av网| 色婷婷久久久亚洲欧美| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产中年淑女户外野战色| 午夜日本视频在线| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美bdsm另类| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩大片免费观看网站| 男人添女人高潮全过程视频| 国产视频首页在线观看| 伦精品一区二区三区| 久久精品久久精品一区二区三区| 黄色日韩在线| 免费观看的影片在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 97在线人人人人妻| 日日撸夜夜添| 亚洲av成人精品一区久久| 日本wwww免费看| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 日本欧美国产在线视频| 99re6热这里在线精品视频| xxx大片免费视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 在线观看www视频免费| 亚洲真实伦在线观看| 欧美日韩av久久| 人体艺术视频欧美日本| 免费观看性生交大片5| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产亚洲91精品色在线| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲美女视频黄频| 成人二区视频| 亚洲精品,欧美精品| 免费黄色在线免费观看| 永久网站在线| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品偷伦视频观看了| 大片免费播放器 马上看| 午夜福利,免费看| 最黄视频免费看| 亚洲国产精品专区欧美| 简卡轻食公司| 免费av不卡在线播放| 国产综合精华液| 精品亚洲成国产av| 国产一区二区在线观看av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 两个人免费观看高清视频 | 下体分泌物呈黄色| 国产男女超爽视频在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产在视频线精品| 又爽又黄a免费视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费看av在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99久国产av精品国产电影| 岛国毛片在线播放| 国产精品女同一区二区软件| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品色激情综合| 成人美女网站在线观看视频| 99久久精品热视频| 我的女老师完整版在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av中文av极速乱| 精品少妇内射三级| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产综合精华液| 亚洲精品一二三| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品一二三| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产美女午夜福利| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产美女午夜福利| 亚洲av国产av综合av卡| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产日韩欧美视频二区| av播播在线观看一区| 性色av一级| 亚洲精品,欧美精品| 久久精品国产亚洲网站| 黄片无遮挡物在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲图色成人| 少妇人妻久久综合中文| 丝袜喷水一区| 大片电影免费在线观看免费| 观看免费一级毛片| 亚洲怡红院男人天堂| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美bdsm另类| 丝袜在线中文字幕| 日本av免费视频播放| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品视频女| 曰老女人黄片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 五月天丁香电影| 国产黄色免费在线视频| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇的逼好多水| 伊人久久精品亚洲午夜| 老司机亚洲免费影院| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品三级大全| 女人久久www免费人成看片| 五月天丁香电影| 亚洲天堂av无毛| 一级爰片在线观看| 午夜免费鲁丝| 日本黄大片高清| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲自偷自拍三级| 十八禁网站网址无遮挡 | 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产免费福利视频在线观看| 亚洲成人一二三区av| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美高清成人免费视频www| av卡一久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 性色av一级| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热这里只有精品一区| 精品一区二区免费观看| 日本91视频免费播放| 在线观看三级黄色| 国产欧美日韩精品一区二区| 一级片'在线观看视频| 精品久久久噜噜| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品久久国产蜜桃| 另类亚洲欧美激情| 久久影院123| 一个人看视频在线观看www免费| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久久久久久久免费av| 男男h啪啪无遮挡| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 午夜福利视频精品| 亚洲成人一二三区av| 男人舔奶头视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产av新网站| 精品亚洲成国产av| 午夜久久久在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产色爽女视频免费观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲欧美日韩东京热| 久久6这里有精品| 熟女电影av网| a 毛片基地| 最新的欧美精品一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 97超碰精品成人国产| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成人免费观看视频高清| 一区二区三区乱码不卡18| 日本免费在线观看一区| 人妻少妇偷人精品九色| 蜜臀久久99精品久久宅男| 如何舔出高潮| 日韩av在线免费看完整版不卡| 秋霞在线观看毛片| 一区在线观看完整版| 欧美成人精品欧美一级黄| av播播在线观看一区| 亚洲国产成人一精品久久久| 各种免费的搞黄视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产日韩一区二区| 一级毛片我不卡| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品国产亚洲网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 欧美激情极品国产一区二区三区 | 一区二区av电影网| 久久精品国产a三级三级三级| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| a级片在线免费高清观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 黄色一级大片看看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 最新的欧美精品一区二区| av线在线观看网站| 亚洲内射少妇av| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 色5月婷婷丁香| 午夜91福利影院| 22中文网久久字幕| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品国产一区二区久久| 国产免费又黄又爽又色| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成人av在线免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 男女无遮挡免费网站观看| 最近中文字幕高清免费大全6|