長(zhǎng)鏈非編碼RNA腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA靶向微小RNA-495-3p調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)

高煒，張莉，金培田

慢性阻塞性肺疾?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱“慢阻肺”）是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性氣道炎癥反應(yīng)疾病，巨噬細(xì)胞參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展［1］，巨噬細(xì)胞的吞噬功能受損可導(dǎo)致慢阻肺病人病情加重，因此調(diào)控炎癥反應(yīng)和抑制肺泡巨噬細(xì)胞凋亡是治療慢阻肺的重要機(jī)制［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在多種疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其中包含慢阻肺，有望成為診斷和治療慢阻肺的靶點(diǎn)［4］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（brain-derived neurotrophic factor antisense，BDNF-AS）是一種lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA BDNF-AS在MPTP誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中上調(diào)表達(dá)，敲除BDNF-AS通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA（miR）-125b-5p提高SH-SY5Y細(xì)胞的活力，抑制MPTP誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞自噬和凋亡［5］。抑制ln‐cRNA BDNF-AS可通過(guò)miR-130b-5p/PRDM5軸抑制急性脊髓損傷中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6］。研究表明miRNA也參與調(diào)控慢阻肺的發(fā)生發(fā)展［7］。過(guò)表達(dá)miR-495-3p可通過(guò)靶向下調(diào)TLR4的表達(dá)，抑制核因子-κB（NF-κB）通路，進(jìn)而抑制炎性因子的產(chǎn)生，促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞增殖［8］。miR-495-3p過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制鞘氨醇-1磷酸受體3（shingosine-1 phosphate re‐ceptor 3，S1PR3）并抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而減輕了輻射引起的肺纖維化［9］。然而lncRNA BDNFAS和miR-495-3p對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制還尚未可知，遂于2018年12月至2019年12月通過(guò)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，研究lncRNA BDNF-AS和miR-495-3p對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及l(fā)ncRNA BDNF-AS是否通過(guò)靶向調(diào)控miR-495-3p的表達(dá)影響其巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383（貨號(hào)XYR005）購(gòu)自無(wú)錫欣潤(rùn)生物公司；胎牛血清、Ham's F12k培養(yǎng)基購(gòu)自上海慧穎生物公司；LPS購(gòu)自北京馳明瑞生公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液購(gòu)自愛(ài)必信（上海）生物公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）一抗購(gòu)自青島捷世康生物公司；兔抗山羊IgG-HRP購(gòu)自南京信帆生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）、碘化丙啶（PI）試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京原平皓生物公司。

1.2細(xì)胞處理與分組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383用含20%胎牛血清的Ham's F12k培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為Con組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，LPS組：細(xì)胞給予LPS（1 mg/L）處理12 h。將BDNF-AS小分子干擾RNA（si-BDNF-AS）及其陰性對(duì)照（si-NC）、miR-495-3p及其陰性對(duì)照（miR-NC）轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞中再用1 mg/L的LPS處理，記為L(zhǎng)PS+si-BDNF-AS組、LPS+si-NC組、LPS+miR-495-3p組、LPS+miR-NC組；將si-BDNF-AS分別與anti-miR-NC、anti-miR-495-3p共轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞中，再用1 mg/L的LPS處理，記為L(zhǎng)PS+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組、LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-495-3p組。將BDNF-AS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-BDNF-AS）、空載體質(zhì)粒（pcDNA）、BDNF-AS小干擾RNA（si-BDNF-AS）、小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞，記為pcDNABDNF-AS組、pcDNA組、si-BDNF-AS組、si-NC組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNABDNF-AS和miR-495-3p的表達(dá)水平各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2?ΔΔCt法計(jì)算。lncRNA BDNF-AS和miR-495-3p分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6為內(nèi)參，lncRNA BDNF-AS正向引物序列：5'-TACCA‐CAAGGTACCAACCATATATG-3'，反向引物序列：5'-CATGTGGTTCTGTTTCAATGCCC-3'；GAPDH正 向引物序列：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，反向引物序列：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'；miR-495-3p正向引物序列：5'-GCGGAAACAAA‐CATGGTGCA-3'，反向引物序列：5'-CTTGCTTCG‐GCATCACA-3'；U6正向引物序列：5'-CGCTTCG‐GCAGCACATATACTA-3'，反向引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取上清，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將0.25%蛋白酶消化的細(xì)胞，接種到無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基過(guò)夜，24 h后收集細(xì)胞，每組選擇3個(gè)樣本，PBS洗滌1次，100μL接種于5 mL流式試管中，5μL的Annexin V-FITC與5μL PI混合后染色，無(wú)光條件下，孵育15 min后注入400μL結(jié)合緩沖液混勻，予以洗滌，后采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡程度。

1.6蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)取各組細(xì)胞，提取總蛋白后用BCA法進(jìn)行定量分析，首先進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電泳完成后經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇活化的聚偏二氟乙烯（PVDF）上，用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，加入稀釋的Bcl-2、Bax一抗（1∶600），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2h，洗膜、顯影、定影后，用ECL熒光試劑盒測(cè)定結(jié)果，拍照并進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析，然后計(jì)算與GAPDH比值求得Bcl-2、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BDNF-AS對(duì)miR-495-3p的靶向調(diào)控利用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建BDNFAS野生型（WT）和突變型（MUT）基因靶點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體后，分別將野生型和突變型BDNF-AS3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）插入LipofectamineTM2000載體，然后按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將其分別與miR-NC和miR-495-3p共轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，嚴(yán)格按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作步驟檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNABDNF-AS、si-NC、si-BDNF-AS轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞中，按照“1.3”中方法檢測(cè)miR-495-3p表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較行成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析+LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1lncRNABDNF-AS和miR-495-3p在LPS刺激的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與Con組相比，LPS組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中BDNF-AS表達(dá)水平升高［（1.00±0.06）比（3.41±0.31），t=22.90，P<0.001］，miR-495-3p表達(dá)水平降低［（1.02±0.07）比（0.47±0.04），t=20.47，P<0.001］。

2.2抑制lncRNABDNF-AS表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響與Con組相比，LPS組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中BDNF-AS表達(dá)水平顯著升高，IL-1β、TNF-α水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平降低；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-BDNF-AS組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中BDNF-AS表達(dá)水平降低，IL-1β、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 抑制腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（BDNF-AS）表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表1 抑制腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（BDNF-AS）表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響/±s

表1 抑制腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（BDNF-AS）表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響/±s

注：Bax為B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與Con組比較，P<0.05。②與LPS+si-NC組比較，P<0.05。

組別Con LPS LPS+si-NC LPS+si-BDNF-AS F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 Bax 0.78±0.07 0.32±0.03①0.31±0.03 0.69±0.06②210.29<0.001 Bcl-2蛋白0.20±0.02 0.61±0.06①0.62±0.06 0.29±0.03②199.06<0.001 BDNF-AS 1.01±0.08 3.15±0.31①3.18±0.29 1.62±0.16②204.09<0.001 IL-1β/（ng/L）22.14±2.25 513.20±41.22①526.14±46.87 132.41±12.58②596.80<0.001 TNF-α/（ng/L）184.33±18.65 1 125.65±110.36①1 203.33±185.22 354.26±21.58②207.74<0.001凋亡率/%8.11±0.81 36.22±3.21①38.14±3.71 12.03±1.25②339.86<0.001

2.3miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響結(jié)果表明，與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-495-3p組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中miR-495-3p表達(dá)水平升高，IL-1β、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2，表2。

表2 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響/±s

表2 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響/±s

注：Bax為B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與Con組比較，P<0.05。②與LPS+miR-NC組比較，P<0.05。

組別Con LPS LPS+miR-NC LPS+miR-495-3p F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 Bax 0.77±0.07 0.31±0.03①0.29±0.03 0.63±0.06②198.06<0.001 Bcl-2蛋白0.21±0.02 0.60±0.06①0.61±0.06 0.33±0.03②168.67<0.001 miR-495-3p 1.00±0.06 0.42±0.04①0.40±0.03 0.78±0.07②277.96<0.001 IL-1β/（ng/L）26.34±2.61 524.33±49.65①536.14±51.02 175.98±18.41②433.04<0.001 TNF-α/（ng/L）193.22±19.24 1 232.11±121.54①1 248.65±115.28 628.47±53.69②300.05<0.001凋亡率/%7.25±0.73 34.58±3.41①36.98±3.61 14.87±1.42②283.57<0.001

圖2 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響

2.4lncRNABDNF-AS調(diào)控miR-495-3p表達(dá)（LncBasePredictedv.2）圖3顯示lncRNA BDNFAS、miR-495-3p具有相關(guān)結(jié)合點(diǎn)位。熒光素酶結(jié)果表明，同miR-NC組比較，miR-495-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)TBDNF-AS活性下降［（1.00±0.05）比（0.38±0.04），t=25.79，P<0.001］；與miR-NC組比較，miR-495-3p組轉(zhuǎn)染MUT-BDNF-AS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（1.02±0.07）比（1.01±0.06），t=0.32，P=0.749］。pcDNA組（0.99±0.08）、pcDNA-BDNF-AS組（0.51±0.05）、si-NC組（1.00±0.07）及si-BDNF-AS組（2.98±0.28）的miR-495-3p表達(dá)水平比較，F(xiàn)=470.24，P<0.001；pcDNABDNF-AS組比pcDNA組低（P<0.05），si-BDNF-AS組比si-NC組高（P<0.05）。

圖3 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（BDNF-AS）的序列中含有與miR-495-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.5沉默miR-495-3p抑制lncRNABDNF-AS表達(dá)對(duì)細(xì)胞活性及炎癥反應(yīng)的影響與LPS+si-BDNFAS+anti-miR-NC組相比，LPS+si-BDNF-AS+antimiR-495-3p組miR-495-3p降低，IL-1β、TNF-α升高，細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 干擾miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（BDNF-AS）表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用/±s

表3 干擾miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反義RNA（BDNF-AS）表達(dá)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用/±s

注：Bax為B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與LPS+si-NC組比較，P<0.05。②與LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別LPS+si-NC LPS+si-BDNF-AS LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-NC LPS+si-BDNF-AS+anti-miR-495-3p F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 Bax 0.30±0.03 0.68±0.06①0.71±0.07 0.39±0.04②138.55<0.001 Bcl-2蛋白0.63±0.06 0.28±0.03①0.26±0.03 0.54±0.05②157.18<0.001 miR-495-3p 1.00±0.06 2.85±0.27①2.89±0.28 1.46±0.15②189.15<0.001 IL-1β/（ng/L）531.41±49.87 141.65±14.33①135.67±13.54 486.33±41.25②362.02<0.001 TNF-α/（ng/L）1 265.33±129.47 365.41±32.45①358.33±30.48 986.37±74.21②308.07<0.001凋亡率/%37.54±3.71 12.65±1.24①11.58±1.19 29.48±2.81②239.28<0.001

3 討論

研究表明lncRNA在細(xì)胞炎癥、免疫等方面具有重要作用，在慢阻肺中異常表達(dá)的lncRNA與慢阻肺發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，有望成為慢阻肺發(fā)生、發(fā)展的早期生物學(xué)標(biāo)志物及治療的潛在靶點(diǎn)［10］。研究報(bào)道抑制lncRNA BDNF-AS可挽救缺氧/復(fù)氧受損鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞死亡和凋亡［11］。抑制lncRNA BDNF-AS減弱了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12］。沉默BDNF-AS增加了Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的活力，并抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激［13］，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的結(jié)果顯示，IL-1β、TNF-α、Bax增加，Bcl-2降低，細(xì)胞的凋亡表達(dá)增加，且BDNF-AS高表達(dá)，說(shuō)明LPS可誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步抑制BDNFAS表達(dá)，結(jié)果顯示IL-1β、TNF-α、Bax降低，Bcl-2升高，細(xì)胞凋亡表達(dá)降低，表示降低BDNF-AS對(duì)抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)具有一定作用，且研究報(bào)道慢阻肺大鼠外周血壓炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高［14］，提示BDNF-AS可能參與慢阻肺進(jìn)展。

研究表明慢阻肺主要出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，而miRNA與炎性疾病相關(guān)，參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞中miR-495-3p下調(diào)表達(dá)［17］。miR-495-3p下調(diào)表達(dá)可能加劇LPS處理的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［18］。miR-495-3p在缺血再灌注損傷小鼠模型和過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-495-3p可抑制TNF-α、IL-1β和IL-18的表達(dá)［19］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中miR-495-3p也低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-495-3p后，IL-1β、TNF-α、Bax降低，Bcl-2升高，細(xì)胞凋亡降低。表示miR-495-3p的過(guò)度反應(yīng)對(duì)降低LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)具有一定影響。且該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)BDNF-AS靶向調(diào)控miR-495-3p，抑制miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了降低了炎性的抑制效能。說(shuō)明lncRNA BDNF-AS對(duì)抑制大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)具有一定作用。

綜上所述，lncRNA BDNF-AS可通過(guò)miR-495-3p干預(yù)LPS誘導(dǎo)大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。