芪參益氣滴丸含藥血清抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究

張新穎

（天津市第四中心醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300241）

中藥復(fù)方研究注重中藥作用整體性，往往局限于臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[1]。有研究顯示，直接應(yīng)用中藥復(fù)方作用于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。另有學(xué)者認(rèn)為，中藥在臨床應(yīng)用過(guò)程中常以復(fù)方形式治療疾病，復(fù)方經(jīng)過(guò)人體的消化與吸收后發(fā)揮藥效可能不同于中藥單一的作用效果。目前，中藥血清藥理學(xué)與血清藥理化學(xué)的研究[2]及兩者的相結(jié)合成為最新的研究熱點(diǎn)，為中藥復(fù)方研究及發(fā)展提供了新的研究方向[3]。本實(shí)驗(yàn)中提取中藥復(fù)方含藥血清作用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，探索細(xì)胞研究中的方法及應(yīng)用，旨在為研究者開(kāi)展血清藥理學(xué)研究提供相應(yīng)的理論與方法支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠11 只，體重180～220 g，6～8 周齡，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，符合動(dòng)物倫理要求。

1.2 試劑及儀器 芪參益氣滴丸（天津天士力制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)）、生理鹽水、CCK8（日本同仁）、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）、胎牛血清（FBS 蘭州百靈優(yōu)級(jí)血清）、倒置相差顯微鏡、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（IL-161HI）、酶標(biāo)儀（flexstation3）、離心機(jī)（LD5-2A）。

1.3 大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）體外培養(yǎng) SD 大鼠提取原代細(xì)胞：3%的水合氯醛腹腔麻醉，打開(kāi)胸腔，用眼科剪及眼科鑷迅速分離出胸主動(dòng)脈，放入無(wú)菌加入1%雙抗的PBS 中。采用高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中含有20%的FBS，1%雙抗，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，1 周后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；若貼壁良好，觀察到細(xì)胞已經(jīng)從組織塊爬出，可更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行首次傳代[4]；每3 天傳代1 次，傳至第3 代更換為含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并經(jīng)血管平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-actin）免疫組織化學(xué)鑒定[5，6]。倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4 芪參益氣滴丸含藥血清制備 首先將大鼠進(jìn)行標(biāo)號(hào)，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分為含藥血清組6 只，正常血清組5 只，含藥血清組給予大鼠芪參益氣滴丸，按0.135 g/（kg·d）灌胃（按照鼠與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)6.25 計(jì)算）[7]，每只大鼠2 ml/（次·d）灌胃，正常血清組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥2 次，中間間隔1 h。最后給藥后1 h，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔麻醉、固定、消毒[8]，無(wú)菌手術(shù)剪打開(kāi)腹腔，分離腹主動(dòng)脈。使用0.2 mm 血樣采集針迎血流方向插入腹主動(dòng)脈，將血接入不抗凝管中。室溫下靜置3～4 h，3000 r/min，離心15 min，無(wú)菌分離血清，同組血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，置于無(wú)菌離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂弥敖?jīng)56 ℃水浴滅活30 min[9]。

1.5 CCK8 測(cè)定芪參益氣滴丸含藥血清對(duì)VSMC 增殖的影響

1.5.1 芪參益氣滴丸含藥血清對(duì)VSMC 影響 取3～8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照3000 個(gè)/孔密度種板。分為1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液同步化組和非同步化組，每組分別再分為5%正常血清組、10%正常血清組、20%正常血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，每組4 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)為24 h 后，加入預(yù)混均勻的100 μl 新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μl 的CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，450 nm 處酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度（OD 值）[10]。

1.5.2 芪參益氣滴丸對(duì)VSMC 增殖的影響 取3～8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照3000 個(gè)/孔密度種板。用含有1%的FBS，1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液同步化24 h，設(shè)定5 個(gè)濃度，即正常血清組：1%正常血清組、3%正常血清組、5%正常血清組、10%正常血清組、20%正常血清組。含藥血清組：1%含藥血清組、3%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，每組4 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)，分別在血清作用6、12、24、48、72 h取樣，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度。檢測(cè)時(shí)，用移液器吸棄待測(cè)孔培養(yǎng)基，并加入預(yù)混均勻的100 μl 新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μl的CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，450 nm處酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊檢驗(yàn)，所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’T3 檢驗(yàn)，P≤0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)2 周后呈放射性生長(zhǎng)，細(xì)胞已經(jīng)融合，部分地區(qū)高低起伏呈“峰-谷”生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多樣，可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形、多角形、不規(guī)則形等（圖1A），符合平滑肌細(xì)胞峰-谷生長(zhǎng)特點(diǎn)；經(jīng)高內(nèi)涵檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)多為梭形和菱形，符合VSMC 形態(tài)。同時(shí)細(xì)胞漿中α-actin 蛋白高度表達(dá)，呈陽(yáng)性，顯示所得細(xì)胞為純度較高的VSMC（圖1B）。

圖1 細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.2 同步化組與非同步化組對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖影響同步化組與未經(jīng)同步化組比較，同步化組細(xì)胞增殖穩(wěn)定，誤差較小；經(jīng)24 h 含藥血清作用，5%含藥血清、10%含藥血清、20%含藥血清均能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，且10%含藥血清抑制更明顯，20%含藥血清抑制相對(duì)較差，見(jiàn)表1、圖2。

圖2 兩組不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖作用比較

表1 同步化與未同步化組含藥血清OD 值比較（）

表1 同步化與未同步化組含藥血清OD 值比較（）

注：Z 表示正常血清組，Q 表示含藥血清組；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 不同濃度梯度及作用時(shí)間對(duì)VSMC 抑制作用1%含藥血清組與1%正常血清組不同時(shí)間點(diǎn)OD 值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；作用于VSMC 6、12 h 后，不同濃度含藥血清組與正常血清組OD 值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；作用于VSMC 24 h后，5%含藥血清組OD 值低于與5%正常血清組（P＜0.01），10%含藥血清組OD 值低于10%正常血清組（P＜0.001）；作用于VSMC 48 h 后，10%、20%含藥血清組OD 值低于正常血清組（P＜0.05）；5%含藥血清OD 值低于5%正常血清組（P＜0.001）；72 h 后不同濃度梯度均出現(xiàn)較其他時(shí)間點(diǎn)下降趨勢(shì)，3%、10%含藥血清組OD 值分別低于同濃度正常血清組（P＜0.05），5%含藥血清OD 值低于5%正常血清組（P＜0.001），見(jiàn)表2、圖3。

圖3 不同濃度含藥血清在不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖作用曲線(xiàn)

表2 不同濃度含藥血清在不同時(shí)間OD 值比較（）

表2 不同濃度含藥血清在不同時(shí)間OD 值比較（）

注：Z 表示正常血清組，Q 表示含藥血清組；24 h，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.01，10%Q 與10%Z 比較，P＜0.001；48h，10%Q 與10%Z 比較，20%Q與20%Z 比較，P＜0.05，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.001；72 h，3%Q 與3%Z 比較、10%Q 與10%Z 比較，P＜0.05，5%Q 與5%Z 比較，P＜0.01

3 討論

中藥成分復(fù)雜多樣，藥物進(jìn)入人體，經(jīng)代謝后產(chǎn)生的新的化合物更是復(fù)雜多樣，且難以探究[11]。血清藥理學(xué)通過(guò)給動(dòng)物灌胃藥物，取其血清作為藥物源進(jìn)行藥理學(xué)觀察，并進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，比較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理作用的真實(shí)過(guò)程，能夠很好的進(jìn)行中藥藥效觀察與研究[12]。提取的含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，能夠防止中藥粗制劑理化性質(zhì)干擾，同時(shí)能夠反映出中藥經(jīng)胃腸道消化吸收后，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的藥理效應(yīng)[13]?，F(xiàn)隨著科學(xué)技術(shù)提高和新技術(shù)的應(yīng)用，中藥的單體成分成功分離，導(dǎo)致中藥整體性被割裂[14]；傳統(tǒng)口服給藥形式，使中藥只有被消化道吸收進(jìn)入體內(nèi)，才能發(fā)揮中藥活性，一部分是中藥本身活性，一部分是中藥進(jìn)入人體產(chǎn)生代謝產(chǎn)物發(fā)揮的活性[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃芪參益氣滴丸提取動(dòng)物血清，并將其作用同源動(dòng)物的平滑肌細(xì)胞，通過(guò)對(duì)血管平滑肌的作用，觀察不同濃度的芪參益氣滴丸含藥血清對(duì)VSMC 的作用。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)同步化后正常血清組及含藥血清組隨濃度升高，細(xì)胞增殖及藥效作用較未同步化穩(wěn)定；經(jīng)同步化更有利于結(jié)果可靠性；同步化的對(duì)照組與含藥血清組比較，含藥血清抑制能夠?qū)ζ交〖?xì)胞增殖，但不隨濃度增加而增強(qiáng)；24 h 后10%含藥血清組較10%正常血清組藥效作用最強(qiáng)，48 h 后5%含藥血清較5%正常血清組藥效作用最強(qiáng)，說(shuō)明在進(jìn)行含藥血清對(duì)平滑肌增殖實(shí)驗(yàn)時(shí)，并不是含藥血清濃度越高，藥效作用越大；芪參益氣滴丸含藥血清抑制血管平滑肌作用較短時(shí)間與正常血清組無(wú)明顯差異，低濃度作用時(shí)間越長(zhǎng)，藥效作用越明顯；高濃度同樣短時(shí)間與正常血清組無(wú)差異，而作用時(shí)間越長(zhǎng)，其藥效的抑制作用并不會(huì)增強(qiáng)，考慮可能與除藥物經(jīng)代謝后的產(chǎn)生的化合物外，血清本身含有的生長(zhǎng)因子有關(guān)。目前研究制備含藥血清給藥方法多樣化，為使藥物能夠達(dá)到穩(wěn)態(tài)需要濃度，現(xiàn)在主要采用每天灌胃1 次，連續(xù)給藥7～10 d[8]及連續(xù)3次給藥法[16]，最后1 次灌胃后間隔1～2 h 取血的方法。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)給藥5 d，最后1 d 為保證藥物濃度穩(wěn)態(tài)加強(qiáng)給藥，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，提取后經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)藥效作用驗(yàn)證，芪參益氣含藥血清能夠抑制血管平滑肌增殖，并與含藥血清濃度及作用時(shí)間密切相關(guān)，與既往研究一致[17]。

綜上所述，在血清藥理研究中，對(duì)于含藥血清的提取必須經(jīng)過(guò)合理的灌胃方法，以保證其含藥物質(zhì)的有效性，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)明確其作用效果。在血清藥理學(xué)研究中，含藥血清中本身含有細(xì)胞增值所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)于研究藥物抑制增值相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)須經(jīng)過(guò)細(xì)胞同步化過(guò)程，以更加準(zhǔn)確的判斷含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。同時(shí)，含藥血清抑制作用并不依賴(lài)含藥血清的濃度，并非濃度越高抑制作用越強(qiáng)，其主要原因是由于增加含藥血清濃度的同時(shí)增加血清中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致，故在研究含藥血清抑制相關(guān)細(xì)胞增勢(shì)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，須探索出最佳作用濃度，以確保含藥血清抑制作用最強(qiáng)。因此，在血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，含藥血清提取、同步化過(guò)程、含藥血清濃度均是決定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功與否的條件。