溫度脅迫對“熱農1號”杧果花粉萌發(fā)的影響

劉馨語，杜成勛，資 晶，肖藝琳，嚴 晶，李春宏，陳東東，王松標，梁清志

(1 四川省攀枝花市仁和區(qū)氣象局，四川攀枝花，617000；2 四川省農業(yè)氣象中心/南方丘區(qū)節(jié)水農業(yè)研究四川省重點實驗室，成都，610072；3 中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江，524091)

杧果MangiferaindicaL.屬于漆樹科杧果屬植物，是重要的熱帶果樹之一[1]。據FAO統計，2015年世界杧果產量超過了4 500萬t，是世界上繼香蕉、葡萄、柑桔和蘋果之后的第5大水果，被譽為“熱帶果王”[2]。中國作為世界第二大杧果生產國，在四川、云南、廣西、海南等熱區(qū)廣泛栽培[3]。目前，金沙江干熱河谷流域晚熟杧果種植面積已超過6.67萬hm2，杧果種植區(qū)主要集中在海拔937～1 500 m之間，氣候干熱，光照充足，晝夜溫差大，獨特的環(huán)境氣候和產業(yè)技術體系的創(chuàng)新共同造就了該地區(qū)優(yōu)異的果品品質。然而，由于缺乏對該區(qū)域杧果晚熟及品質形成機制的研究，尚未能很好地解釋該區(qū)域杧果“晚熟”和“品質一流”的成因，不能更有效地突出地區(qū)品牌和價格優(yōu)勢，影響了金沙江干熱河谷流域晚熟杧果產業(yè)整體效益的充分發(fā)揮。

杧果多為異花授粉亦能自花結實，少數品種表現自交不親和[4]。其花粉數量是影響著果率和產量的因素之一[5]。杧果的花柱和柱頭都較小，萌發(fā)花粉數量較少，通常只有1～3個花粉管萌發(fā)進入花柱，并且只有1個花粉管能生長到達子房內部完成受精[6]。許多研究表明[7-8]，開花期對溫度的要求最為嚴格，溫度脅迫常常會引起花粉敗育及花粉與柱頭發(fā)育不同步等現象[9]。將花粉作為表征植物物種或基因型耐受性的有利標記可知[10]，低溫和高溫脅迫大多對花粉的表現有不利影響[11]。低溫和高溫脅迫以不同速率降低了不同杏仁基因型的花粉萌發(fā)率和花粉管長度[12]。同樣，高溫脅迫導致不同基因型花生和椰子花粉萌發(fā)和花粉管生長以不同速度下降[13]。低溫誘導不同基因型杏仁和甜櫻桃花粉萌發(fā)和花粉管伸長的反應也不同[14]。由此可以看出，不同基因型對溫度脅迫的花粉萌發(fā)率和花粉管生長差異性可以用來評估物種或基因型的耐受性[15]。為此，累積應激反應指數(Cumulative Stress Response Index)通常用來表示不同基因型在應激條件下的相對敏感性[16-17]。因此，溫度脅迫對花粉萌發(fā)、花粉管長度的影響可作為評價不同基因型花粉抗性和耐受性的指標。近年來，由于全球氣候變化，導致極端天氣越來越頻繁，杧果花期倒春寒和干熱風已經成為制約金沙江干熱河谷晚熟杧果產業(yè)發(fā)展的重要問題，嚴重影響植物花期花粉的萌發(fā)及著果。由于這些影響都將直接造成嚴重的經濟損失，因此溫度對花粉萌發(fā)階段的影響研究越來越受到重視。此外，為了確保農業(yè)的可持續(xù)性，識別、分辨花粉對極端天氣的響應和耐受度變得越來越重要。為此，關注溫度對花粉的響應是非常重要的。

本研究以西南山地杧果主栽品種“熱農1號”為供試品種，通過離體萌發(fā)的方法，對其進行不同程度的溫度脅迫，結合累積應激反應指數(CSRI)，明確“熱農1號”杧果花期最適溫度以及花粉活力高溫及低溫臨界值，以期為更好地闡明花粉響應高低溫脅迫的分子機理、及制訂相應的抵御溫度脅迫生產技術措施等提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

“熱農1號”杧果花粉于2021年3月取自中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所杧果種質資源圃，在盛花期(開花數占總花量的15%～75%)隨機選取當天開放的新鮮花藥放入培養(yǎng)液中，充分震蕩后迅速帶回實驗室用于溫度脅迫的觀察及研究分析。

1.2 方法

配置杧果花粉培養(yǎng)液：將蔗糖150 g、硼酸150 mg、硫酸鈣6.0 mg、硫酸鎂100 mg、硝酸鉀100 mg、聚乙二醇250 g混合，定溶至1 L。將培養(yǎng)液加熱煮沸待其充分溶解，冷卻后裝瓶常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

采集花粉與預處理：將配置好的培養(yǎng)液分裝在500 μL離心管中，每個離心管里隨機取花藥12～15粒，充分震蕩使花藥上的花粉附著于培養(yǎng)液中。

不同溫度條件下花粉離體培養(yǎng)：將離心管分別存放于14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 ℃的培養(yǎng)箱中分別進行1、3、5 h培養(yǎng)。

不同溫度條件下花粉萌發(fā)率的測定：取干凈凹面載玻片，向凹穴滴入1～2滴混合均勻的培養(yǎng)液進行觀察，每處理重復3次，每重復隨機選取5個視野，共觀察花粉粒200～500粒。以花粉管長度超過花粉粒直徑為花粉萌發(fā)標準，分別觀察1、3、5 h持續(xù)培養(yǎng)下不同溫度處理的萌發(fā)花粉數、花粉總數并統計萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)率(%)=萌發(fā)花粉數/花粉總數×100。

花粉管長度測定：制備3張載玻片，使用光學顯微鏡(Olympus BX-51)測量每張載玻片大約50個萌發(fā)花粉粒的長度，取平均值。

1.3 累積應激反應指數(CSRI)測定

以對照(c)組和處理(t)組的花粉萌發(fā)率(GR)和花粉管長度(TL)為指標，測定花粉管對溫度脅迫的響應，計算CSRI[16]。CSRI=(GRt-GRc)/GRc+(TLt-TLc)/TLc×100。

1.4 數據分析

采用Excel和SPSS 18.0統計分析數據，采用單因素方差分析(ANOVA)，p值小于0.05。

2 結果與分析

花粉不同萌發(fā)狀態(tài)見圖1。從圖2可以看出，花粉萌發(fā)率隨溫度的變化呈類似正態(tài)分布。22 ℃，“熱農1號”的花粉平均萌發(fā)率為9.3%；隨后隨溫度上升，花粉萌發(fā)率呈明顯增加的趨勢；28 ℃時達最大值，為37.2%；當花粉萌發(fā)溫度在最適溫度(28 ℃)以上時，花粉萌發(fā)率又隨溫度升高迅速下降。說明低溫和高溫均對杧果花粉離體萌發(fā)具有明顯的抑制作用。當溫度低于20 ℃，“熱農1號”花粉不萌發(fā)；高于32 ℃，溫度開始抑制花粉萌發(fā)，不僅影響花粉粒萌發(fā)，而且抑制花粉管伸長；34 ℃時，花粉萌發(fā)率全部降至2.0%以下。在22～32 ℃溫度范圍內，花粉管生長良好，平均長度可達花粉直徑的3～4倍，說明“熱農1號”花粉萌發(fā)溫度為22～32 ℃，其中最適溫度為28 ℃，高于32 ℃或低于22 ℃都會抑制花粉萌發(fā)，最終可能影響“熱農1號”授粉和著果。杧果花粉一般培養(yǎng)1 h開始萌發(fā)，培養(yǎng)5 h后已基本萌發(fā)，隨后萌發(fā)率及花粉管長度隨培養(yǎng)時間的延長不再有明顯變化[6]。由于培養(yǎng)時間超過20 h，培養(yǎng)基受污染開始大量生長菌絲，不利于萌發(fā)率的統計[13]。因此，本研究分別對花粉進行持續(xù)1、3、5 h培養(yǎng)觀察。

圖1 “熱農1號”杧果離體花粉不同萌發(fā)狀態(tài)

圖2 不同溫度與時間處理對“熱農1號”杧果離體花粉萌發(fā)和花粉管長度的影響

隨著溫度脅迫時間的持續(xù)增加，當溫度低于20 ℃，花粉均無萌發(fā)，且不同時間處理的花粉萌發(fā)率無明顯差異；當溫度介于22～32 ℃之間，花粉萌發(fā)率受處理時間的影響差異明顯，隨處理時間的增加，花粉萌發(fā)率顯著降低；當溫度高于34 ℃，花粉無萌發(fā)，且花粉管形態(tài)異常。其中，處理時間越長，高溫的影響更明顯。

32 ℃持續(xù)處理5 h后，花粉萌發(fā)率降低至10%以下；而34 ℃持續(xù)處理1 h和3 h，花粉萌發(fā)率降至2.0%以下。對于低溫而言，22 ℃持續(xù)處理5 h后，花粉萌發(fā)率降至5.1%；1 h處理的花粉萌發(fā)率為13.1%。說明隨著處理時間延長，花粉萌發(fā)適宜溫度范圍縮小，即長時間的極端溫度脅迫會抑制花粉萌發(fā)。

試驗發(fā)現，不同時間處理的花粉萌發(fā)率均以28 ℃時最高，其中1 h處理的花粉萌發(fā)率最高，為37.2%。低溫或高溫脅迫下，花粉萌發(fā)率下降，即極端低溫(22 ℃)處理1、3、5 h后花粉萌發(fā)率分別下降64.7%、73.2%、86.0%；極端高溫(32 ℃)處理1、3、5 h后花粉萌發(fā)率分別下降51.8%、60.6%、74.2%。由此可知，花粉萌發(fā)受到極端低溫或高溫脅迫失活后，在脅迫時間上無顯著性差異。不同溫度相同處理時間的花粉管長度以28℃時最長，相同溫度不同處理時間以5 h處理的花粉管長度最長。然而，極端低溫或高溫脅迫下花粉管的生長卻出現了退化。低溫(22 ℃)脅迫下1 h的花粉管長度減少了55.0%，3 h減少了43.5%，5 h減少了40.0%。高溫(32 ℃)脅迫1、3、5 h下花粉管長度分別減少約27.5%，32.6%，30.0%。說明與高溫脅迫相比，低溫脅迫對花粉管生長的抑制作用更大。試驗中，22 ℃處理1、3、5 h的CSRI分別為-102.94、-93.24、-90.95，32 ℃處理1、3、5 h的CSRI分別為-71.10、-56.84、-69.52。低溫(22 ℃)脅迫下CSRI均小于高溫(32 ℃)脅迫，說明“熱農1號”對低溫更敏感。

3 結論與討論

試驗結果表明，杧果花粉萌發(fā)對低溫或高溫脅迫及脅迫時間都具有敏感性。在不同溫度和時間處理下，杧果花粉萌發(fā)率和花粉管長度均有變化。對龍眼[18]、扁桃[12]和椰子[19]等作物的研究發(fā)現，低溫對作物花粉萌發(fā)和花粉管生長有抑制作用；對菜豆[20]、大豆[21]、水蜜桃[22]等作物的高溫脅迫研究表明，高溫對其生長發(fā)育抑制作用也很明顯，本研究結果類似。關于溫度變化對花粉萌發(fā)的不利影響，一些研究人員將不同物種甚至不同基因型的響應程度聯系起來[23]，在溫度脅迫下對花粉進行性能測試[24]。

我國杧果主要在南方熱區(qū)廣泛栽培，生產中，杧果花期常遭遇低溫陰雨天氣導致花粉母細胞減數分裂異常，進而授粉受精不良而出現落果[24]。對“熱農1號”不同溫度條件下花粉萌發(fā)率和花粉管長的累積應激反應指數(CSRI)分析發(fā)現，低溫對花粉管的生長有明顯抑制作用，與前人研究一致。對“熱農1號”不同溫度脅迫下花粉萌發(fā)率變化分析發(fā)現，高溫比低溫對杧果花粉萌發(fā)造成的破壞性影響更大[25]。

范眸天等[5]研究發(fā)現，杧果花粉20 ℃以下無萌發(fā)，與本試驗結果一致。本研究結果表明，22 ℃以下和32 ℃以上溫度，花粉活力隨溫度脅迫時間延長變化較緩慢；而24～30 ℃時花粉活力隨時間變化比較迅速；20 ℃以下和34 ℃以上溫度花粉無萌發(fā)，隨脅迫時間延長，花粉萌發(fā)率無明顯變化。說明“熱農1號”杧果花粉萌發(fā)溫度介于22～32 ℃之間，其中花粉萌發(fā)最適溫度范圍為24～30 ℃。

采用離體萌發(fā)法，于盛花期對“熱農1號”杧果花粉進行不同溫度和持續(xù)時間的處理發(fā)現，溫度和持續(xù)時間均對花粉活力有明顯影響，花粉萌發(fā)率隨溫度變化呈類似正態(tài)分布；24～30 ℃溫度范圍內花粉活力較好，當溫度高于32 ℃或高溫處理時間5 h對花粉活力傷害均較大，低于20 ℃或高于34 ℃花粉不萌發(fā)。結合累積應激反應指數(CSRI)分析發(fā)現，低溫對花粉管長度影響更明顯，高溫對花粉萌發(fā)影響更大?？偟膩碚f，“熱農1號”杧果生殖期對低溫脅迫更敏感。