玉米甲硫氨酸合酶基因METS的克隆及表達(dá)特性

任瑩 連通 張春義 姜凌

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，甲硫氨酸起著非常重要的作用，它不僅是蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)，而且是甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的前體［1］。葉酸是一種非常重要的水溶性B族維生素，作為一碳單位的供體參與很多代謝反應(yīng)［2］。甲硫氨酸合酶是產(chǎn)生甲硫氨酸和四氫葉酸的關(guān)鍵酶，以5-甲基四氫葉酸和同型半胱氨酸作為底物，通過(guò)甲硫氨酸代謝途徑生成甲硫氨酸和葉酸［3］。人體長(zhǎng)期缺乏甲硫氨酸和葉酸會(huì)增加脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤發(fā)生的概率，甚至?xí)?dǎo)致結(jié)直腸癌和乳腺癌的發(fā)生［4］。甲硫氨酸和葉酸主要從植物性膳食中攝取，但它們?cè)谧魑锓N子中含量相對(duì)不高，特別是甲硫氨酸在豆類植物（如大豆和豌豆等）種子中的比例尤其不足［5］。以植物為主的膳食，其甲硫氨酸的含量只有平衡膳食所需量的50%-75%［6］，葉酸的攝入量也只有世界衛(wèi)生組織推薦攝入量的45%-75%［7］。

玉米（Zea mays L.）是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)糧食作物之一，是我國(guó)種植面積最大的糧食作物［8］。因此，了解玉米甲硫氨酸的積累及其如何影響種子的萌發(fā)對(duì)提高玉米籽粒品質(zhì)和種子萌發(fā)率具有重要意義。

甲硫氨酸作為葉酸代謝與含硫氨基酸代謝的連接點(diǎn)，如何提高作物中的含量也被廣泛研究［9-17］。目前，研究者提高作物中甲硫氨酸含量并改善種子的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)主要是通過(guò)過(guò)表達(dá)種子特異、富含甲硫氨酸的貯藏蛋白，減少缺乏甲硫氨酸的貯藏蛋白，沉默甲硫氨酸分解酶，或者上調(diào)參與甲硫氨酸合成的關(guān)鍵生物合成酶［9-13］。如，在馬鈴薯和擬南芥中通過(guò)RNA干擾降低了蘇氨酸合成酶（threonine synthetase，TS）轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致甲硫氨酸水平顯著增加30倍和47倍［10-14］；在亞麻中過(guò)表達(dá)O-乙酰絲氨酸裂解酶（O-acetylserine（thiol）-lyase，OASTL），甲硫氨酸含量增加3-8倍［15］；在擬南芥中過(guò)表達(dá)甲硫氨酸-S-腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine-sadenosyltransferase，MMT）和同型半胱氨酸-S-腺苷轉(zhuǎn) 移 酶（homocysteine-s-adenosyltransferase，HMT）都可以檢測(cè)到甲硫氨酸含量的增加［16］；過(guò)表達(dá)擬南芥胱硫醚 γ-合酶（cystathionine γ-synthase，CGS）的馬鈴薯塊莖中的甲硫氨酸含量是野生型塊莖的2倍［17］；在水稻中組成型過(guò)表達(dá)大腸桿菌絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（serine acetyltransferase，SAT）導(dǎo)致游離蛋氨酸增加40%，而蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸顯著增加了近5倍［18］；在大豆中引入富硫蛋白質(zhì)的合成基因，種子中甲硫氨酸和半胱氨酸分別顯著增加16%和66%［19］。不過(guò)在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)編碼甲硫氨酸合酶的基因，甲硫氨酸水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化［20］。

近年來(lái)，對(duì)于甲硫氨酸合酶的研究主要來(lái)自模式生物擬南芥和煙草。擬南芥的甲硫氨酸合酶被認(rèn)為同時(shí)存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，分別參與甲硫氨酸的從頭合成與甲基代謝［21］。在煙草花中，甲硫氨酸合酶的轉(zhuǎn)錄物積累模式與甲基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄物積累模式完全匹配［22］。其他研究表明，甲硫氨酸對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)也非常重要。參與甲硫氨酸代謝的酶豐度在萌發(fā)期間迅速增加［23］。甲硫氨酸也可能通過(guò)腺苷甲硫氨酸促進(jìn)乙烯和多胺的合成，進(jìn)一步促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)［24］，同時(shí)可以激活擬南芥谷氨酸受體同源物AtGLR 3.5 Ca2+通道，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，抑制ABA不敏感轉(zhuǎn)錄因子（ABSCISIC ACID INSENSITIVE 4）表達(dá)，降低種子對(duì)ABA的敏感性，促進(jìn)種子萌發(fā)，最終使種子萌發(fā)率升高［25］。

目前，關(guān)于作物甲硫氨酸合酶基因的功能研究鮮見(jiàn)報(bào)道，急需開(kāi)展作物中甲硫氨酸和葉酸的積累機(jī)制的研究。本研究擬克隆玉米甲硫氨酸合酶編碼的3個(gè)同源基因METS1、METS2和METS3，在組織表達(dá)特性和萌發(fā)過(guò)程中，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)其進(jìn)行分析，為深入研究甲硫氨酸合酶在玉米籽粒甲硫氨酸和葉酸積累過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為玉米自交系B73，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存，2021年4月種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所試驗(yàn)田（河北省廊坊萬(wàn)莊）。取B73的根、莖、葉、雄穗、幼嫩雌穗和授粉后25 d的籽粒、胚及胚乳，用液氮迅速冷凍，-80℃保存。取B73玉米干種子于25℃純凈水中進(jìn)行萌發(fā)，取萌發(fā)時(shí)間為0、12、24、36、48、60和72 h的籽粒于液氮中速凍，-80℃保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 總RNA提取試劑盒購(gòu)自百奧曼科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；高保真DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、pEASY?-Blunt Cloning Kit、實(shí)時(shí)熒光定量TransStart Top Green qPCR SuperMix購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)T1購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。引物（表1）合成及測(cè)序由華大基因完成。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 ZmMETS的克隆 提取B73葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴(kuò)增ZmMETS。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，與克隆載體pEASY?-Blunt連接，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證序列是否為目的序列。

1.2.2 ZmMETS的生物信息學(xué)分析 利用ProtScale程序（https://expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析蛋白質(zhì)疏水性；利用ProtParam分析蛋白的理化性質(zhì)；使用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；利用SWISS-MODEL（https://SWISSMODEL.expasy.org）預(yù)測(cè) ZmMETS1/ZmMETS2/ ZmMETS3的三維結(jié)構(gòu)；用MEGA7.0軟件中的最大似然法（Maximum likelyhood method）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 ZmMETS的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 使用全式金試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體系的配制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序?yàn)?4℃ 30 s；94℃ 5 s，58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；根據(jù)賽默飛世爾科技QuantStudio1儀器設(shè)定溶解曲線程序。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。以玉米甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）編碼基因ZmGAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 ZmMETS的蛋白信息分析

提取B73葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，運(yùn)用RT-PCR方法分別獲得包括開(kāi)放閱讀框的3個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為2 352、2 822和2 758 bp。挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序后得到ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3開(kāi)放閱讀框的核苷酸序列。經(jīng)過(guò)分析，ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3核苷酸編碼序列長(zhǎng)度分別為2 301、2 298和 2 298 bp。

通過(guò)軟件預(yù)測(cè)明確3個(gè)蛋白的分子量均為84.5 kD，均為親水性蛋白質(zhì)（圖1-A-C）。ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3的等電點(diǎn)分別為5.54、5.83和5.85。這3個(gè)蛋白都含有2個(gè)非依賴鈷胺素合酶結(jié)構(gòu)域（圖1-D-F），分別位于N端和C端。

圖1 ZmMETS的親疏水性和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of hydrophilicity，hydrophobicity，and protein domain of ZmMETS

3個(gè)ZmMETS蛋白結(jié)構(gòu)高度相似，都含有分別負(fù)責(zé)結(jié)合和催化的2個(gè)結(jié)構(gòu)域。利用Swiss-model在線網(wǎng)站對(duì)ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示3個(gè)蛋白得到的預(yù)測(cè)模型一樣，含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，合酶1結(jié)構(gòu)域位于N端，執(zhí)行結(jié)合功能，合酶2結(jié)構(gòu)域位于C端，執(zhí)行催化功能，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由α螺旋環(huán)繞平行的β片層構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)，甲硫氨酸位于C端結(jié)構(gòu)域（圖2）。將代表性物種中的METS同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，玉米中的METS和高粱的同源蛋白親緣關(guān)系最近（圖3）。

圖2 ZmMETS的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，甲硫氨酸位于C端結(jié)構(gòu)域Fig.2 Three-dimensional structure prediction of ZmMETS，and methionine locates in C-terminal domain

圖3 METS同源基因的進(jìn)化分析Fig.3 Evolutionary analysis of METS homologous proteins

2.2 ZmMETS的組織表達(dá)模式分析

通過(guò)提取散粉時(shí)期玉米的根、莖、葉、雄穗、雌穗以及授粉后25 d的胚、胚乳、籽粒的RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究ZmMETS同源基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這3個(gè)同源基因在玉米的各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，ZmMETS1的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ZmMETS2和ZmMETS3（圖4-A）。以根中表達(dá)為對(duì)照，ZmMETS1在莖和雌穗中表達(dá)量較高，在葉片中表達(dá)量較低（圖4-B）；ZmMETS2在莖、雌穗和胚乳中的表達(dá)量差異不明顯，而在葉、胚和籽粒中表達(dá)很低（圖4-C）；ZmMETS3在雌穗中表達(dá)量較高，在胚和籽粒中較低（圖4-D）。因此，推測(cè)ZmMETS1在植株的各個(gè)部位起主要作用。

圖4 ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expressions of ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3 in different tissues

2.3 萌發(fā)過(guò)程中ZmMETS的表達(dá)模式分析

將玉米B73自交系的種子在清水中浸泡36 h，下胚軸突破種皮，72 h時(shí)下胚軸長(zhǎng)約1 cm。從浸種開(kāi)始，ZmMETS1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于ZmMETS2和ZmMETS3（圖5-A）。ZmMETS1在12 h后表達(dá)量急劇增高，36 h達(dá)到高峰，然后下降為最高峰的1/2（圖5-B）；ZmMETS2在36 h內(nèi)表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，然后下降為初始的1/10（圖5-C）；ZmMETS3的變化模式與ZmMETS1類似，12 h后急劇增高，36 h達(dá)到高峰，48 h表達(dá)量急劇下降，僅為最高峰的1/4，60 h又增高，達(dá)到24 h的水平，然后再緩慢下降（圖5-D）。這說(shuō)明不同的同源基因在萌發(fā)中的轉(zhuǎn)錄模式不同。

圖5 ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS13在萌發(fā)過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expressions of ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3 during germination

3 討論

植物中甲硫氨酸合酶不僅催化從頭合成中的最后一個(gè)反應(yīng)，而且還用于甲基的重復(fù)再利用，其蛋白結(jié)構(gòu)是比較保守的［20，26］。前人開(kāi)展的研究主要都集中在擬南芥和擬南芥基因在作物中的外源表達(dá)，而作物自身編碼基因的功能鮮見(jiàn)報(bào)道［10，25，27］。本試驗(yàn)從B73的葉片組織中分別克隆得到了ZmMETS的3個(gè)同源基因，Swiss-model三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示它們編碼的蛋白N段具有典型的非依賴鈷胺素合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C段具有典型的非依賴鈷胺素合酶催化結(jié)構(gòu)域，屬于甲硫氨酸合酶家族基因［26］，還需要進(jìn)一步的酶學(xué)試驗(yàn)證實(shí)。

ZmMETS同源基因的組織表達(dá)模式的共性在于它們?cè)诖扑胫械谋磉_(dá)水平較高，在其他部位則表達(dá)模式各自不同。ZmMETS1在各組織中的表達(dá)量均最高，只是在葉片中表達(dá)水平低一些，約為根中表達(dá)量的一半；ZmMETS2在葉片、胚和籽粒中的表達(dá)水平都只有根的15%；ZmMETS3在雌穗中的表達(dá)水平最高，在胚和籽粒中表達(dá)水平最弱。這個(gè)現(xiàn)象與在擬南芥中的觀察類似，擬南芥中AtMETS1轉(zhuǎn)錄水平總體很高，在花中的轉(zhuǎn)錄水平最高；不同的地方在于擬南芥3個(gè)同源基因的根部的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)其他部位來(lái)說(shuō)很低；AtMETS2主要在莖中轉(zhuǎn)錄水平高，而AtMETS3主要在種子中轉(zhuǎn)錄［20］。這說(shuō)明不同物種中甲硫氨酸合酶具體執(zhí)行的功能可能根據(jù)不同組織的甲基代謝與一碳代謝的需求而不同，其具體生物功能有待進(jìn)一步深入研究。

種子萌發(fā)過(guò)程中，一碳代謝與甲硫氨酸代謝都在發(fā)生劇烈的變化。豌豆萌發(fā)2 d時(shí)，葉酸含量是種子的2倍以上，HPPK/DHPS的mRNA豐度是初始的5倍［28］。玉米中主要變化的是5甲基四氫葉酸，2 d時(shí)5甲基四氫葉酸的含量相對(duì)是初始的1 000多倍，特別是4尾形式的葉酸占比顯著增加［29］。擬南芥中，萌發(fā)1 d時(shí)，甲硫氨酸的含量接近初始的2倍，AtMETS1是初始的25倍以上，然后緩慢下降，到48 h時(shí)為初始的5倍左右；AtMETS2和AtMETS3幾乎沒(méi)有變化，48 h時(shí)增加為初始的5倍左右［24］。玉米中ZmMETS同源基因在萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)模式不同于擬南芥中的觀察。盡管ZmMETS1是轉(zhuǎn)錄水平最高的基因，它和ZmMETS3隨時(shí)間的轉(zhuǎn)錄模式很類似，都是在萌發(fā)后轉(zhuǎn)錄水平急劇增加，36 h時(shí)達(dá)到高峰，然后下降；ZmMETS2轉(zhuǎn)錄水平在48 h顯著低于初始。這說(shuō)明這3個(gè)同源基因可能參與的生物學(xué)過(guò)程有所不同，其調(diào)控機(jī)制差異需要進(jìn)一步詳細(xì)分析。

4 結(jié)論

玉米中存在3個(gè)具有組成型表達(dá)特征的玉米甲硫氨酸合酶基因，ZmMETS1可能在雌穗發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程中起主要作用。