菌黃保腸合劑對膿毒癥大鼠腸道菌群及血清炎癥因子的影響研究?

李建洪 陳 斌 鐵明慧 李巽華 龔瑞瑩 謝招虎 龐永誠△

（1.云南省昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500）

膿毒癥為感染所致的宿主反應失調(diào)綜合征，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)及精神狀態(tài)改變等，為重癥患者死亡的重要原因［1］。全球每年患病人數(shù)接近2 000萬，病死率超過25%［2］。腸道是膿毒癥影響最早的器官，腸道菌群失調(diào)可引發(fā)病理性細菌移位，進而誘發(fā)機體產(chǎn)生大量炎癥因子，進一步加重炎癥反應［3］。目前西醫(yī)調(diào)節(jié)腸道菌群的主要方法為補充腸道益生菌、腸內(nèi)營養(yǎng)、益生菌與抗生素聯(lián)合運用等，臨床療效有待提高［4］。而中醫(yī)藥不僅從臨床還是動物實驗研究，都已證實某些單味中藥或復方制劑均有調(diào)節(jié)腸道菌群及降低炎癥因子水平的作用。菌黃保腸合劑為昆明市中醫(yī)醫(yī)院特色院內(nèi)制劑，具有健脾益氣、清熱利濕之功效，臨床運用多年，效果明顯。本研究通過觀察菌黃保腸合劑對膿毒癥大鼠腸道菌群的改善及血清炎癥因子的作用，進一步探討中醫(yī)藥對于搶救危重癥的臨床應用價值?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠110只，體質(zhì)量（220±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（滇）2017-005。研究經(jīng)云南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審查通過，批準文號：R-06201903。

1.2 實驗藥物 菌黃保腸合劑（黃芪、茯苓、白術、太子參、炒黃連、薏苡仁、神曲、茵陳及石菖蒲），由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備，具體制備過程：取黃芪300 g，茯苓150 g，白術100 g，太子參200 g，炒黃連100 g，薏苡仁300 g，神曲150 g，茵陳100 g，石菖蒲100 g，置于煎煮容器中煎煮2次，每次加入6倍水量，煎煮50 min，濾液過80目篩，合并兩次濾液，濾液濃縮至10 000 mL，加入1‰苯甲酸鈉、0.5‰尼泊金乙酯，攪拌均勻即得，規(guī)格：100 mL/瓶，批準文號：Z20082615A，成人臨床日劑量為22.5 mL。雙歧桿菌腸溶膠囊，麗珠醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：0.35 g/粒，國藥準字S10960040，成人臨床日劑量為1.4 g。

1.3 試劑與儀器 DNeasy PowerSil kit（QIAGEN，12888）、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit（QIA?GEN，51531）、Qubit dsDNA Assay kit（Life Technologies，Q32854）、Tks Gflex DNA Polymerase（Takara，R060B）。臺式高速離心機（Eppendorf，Centrifuge 5418）、PCR儀（Bio-rad，580BR10905）、QIAxtractor（QIAGEN，SN002358）、電泳儀（Tanon，HE-120）、凝膠成像儀（Tanon，2500）及超低溫冰箱等。

1.4 造模及分組 采用盲腸結扎穿孔法對大鼠進行造模，先將大鼠適應性喂養(yǎng)1周，實驗前12 h禁食不禁水，麻醉，剖開腹腔，找出回盲部，在距其末端2 cm處以1號絲線結扎，將腸道內(nèi)容物推向回盲部遠端，用1號針頭貫穿穿刺，擠出少許糞便，回納盲腸，生理鹽水復蘇，完成膿毒癥大鼠的造模。造模成功后將大鼠分成假手術組、模型組、陽性對照組、菌黃保腸合劑低劑量組、菌黃保腸合劑中劑量組及菌黃保腸合劑高劑量組6組。

1.5 干預方法 造模結束后1 d開始給藥。菌黃保腸合劑成人用量為90 mL/d，約生藥13.5 g/d，按體表計算法得出大鼠低、中、高劑量分別為1.22、6.10、12.20 mg/g，每日2次灌胃。陽性對照組予雙歧桿菌粉5 mg/g，每日2次灌胃。假手術組和模型組予生理鹽水3 mL，每日2次灌胃。各組共治療3 d。

1.6 標本采集及檢測 用藥3 d后各組大鼠在無菌環(huán)境下麻醉，開腹，收取結腸組織行細菌培養(yǎng)，經(jīng)腹主動脈采血6 mL，3 000 r/min離心15 min，收取上層清液，保存于-80℃冰箱備用。1）腸道菌群的測定。收取大鼠結腸組織，行細菌基因組DNA提取，運用16SrDNA通用引物對16SrDNA序列進行擴增，擴增后行SDSPAGE電泳，運用NCBI數(shù)據(jù)庫對細菌進行比較，最后篩選出大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌并進行定量分析。2）血清炎癥因子水平測定。采用免疫比濁法檢測血清降鈣素原（PCT）水平，采用ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用F檢驗，采用率或百分比表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠存活率比較 見表1。治療3 d后，假手術組大鼠全部存活，模型組存活率明顯低于假手術組（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組、菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠存活率顯著升高（P<0.05）；與陽性對照組比較，菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠存活率明顯升高（P<0.05）；菌黃保腸合劑各劑量組間大鼠存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠存活率比較

2.2 各組大鼠腸道菌群定量分析比較 見表2。與假手術組比較，模型組大鼠結腸組織中大腸桿菌含量顯著增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌含量顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組及菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠結腸組織中大腸桿菌含量明顯減少，雙歧桿菌和乳酸桿菌含量明顯增加（P<0.05）；與陽性對照組比較，菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠結腸組織中大腸桿菌含量減少（P<0.05），雙歧桿菌和乳酸桿菌含量增加（P<0.05）；菌黃保腸合劑各劑量組間大鼠結腸組織大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠腸道菌群定量分析比較（Log10N/g，±s）

表2 各組大鼠腸道菌群定量分析比較（Log10N/g，±s）

組別假手術組模型組陽性對照組菌黃保腸合劑低劑量組菌黃保腸合劑中劑量組菌黃保腸合劑高劑量組n 10 8 12 14 14 15大腸桿菌6.17±0.45 14.64±0.63*11.21±0.84△8.14±0.48△#8.33±0.49△#7.73±0.38△#雙歧桿菌10.24±0.74 2.74±0.53*6.64±0.54△7.04±0.44△#7.57±0.47△#7.64±0.58△#乳酸桿菌8.55±0.69 1.21±0.48*3.13±0.51△4.79±0.62△#4.11±0.42△#5.13±0.64△#

2.3 各組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比較 見表3。與假手術組比較，模型組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組及菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平明顯降低（P<0.05）；與陽性對照組比較，菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平降低（P<0.05）；菌黃保腸合劑各劑量組間大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6水平比較（±s）

組別假手術組模型組陽性對照組菌黃保腸合劑低劑量組菌黃保腸合劑中劑量組菌黃保腸合劑高劑量組n 10 8 12 14 14 15 PCT（ng/mL）0.77±0.29 4.89±1.17*3.85±0.94△3.12±0.85△#2.86±0.81△#2.16±0.47△#TNF-α（ng/mL）8.22±0.77 34.71±2.12*20.43±1.57△18.13±1.54△#17.73±1.55△#14.43±1.21△#IL-6（pg/mL）14.04±1.42 42.13±5.73*30.98±4.15△28.32±3.73△#26.71±3.14△#21.04±2.26△#

3 討論

膿毒癥發(fā)生時，機體處于應急狀態(tài)，胃腸道黏膜缺血缺氧，腸道生態(tài)結構紊亂，進而引起菌群失調(diào)，致病菌大量繁殖，腸道大量的細菌及毒素進入血循環(huán)，觸發(fā)細菌易位。易位的細菌成為致病菌，參與炎癥反應，加重膿毒癥的發(fā)生發(fā)展?？股氐氖褂檬侵委熌摱景Y的基礎及必要措施，但隨著廣譜抗生素的廣泛應用，微生物對抗生素的耐藥性日益加重，必將誘發(fā)患者腸道生態(tài)平衡的紊亂甚至是多重耐藥菌株感染，這一情況已成為當前膿毒癥治療非常棘手的問題［5］。西醫(yī)治療膿毒癥腸道菌群紊亂主要采用腸道營養(yǎng)、補充益生菌及護胃抑酸等。而中醫(yī)藥治療膿毒癥腸道菌群的優(yōu)勢在于不僅能從根本上調(diào)節(jié)機體陰陽平衡，亦能針對脾胃有的放矢［6］。TNF-α在炎癥反應中起主導作用，可作為膿毒癥的啟動因子，能激活細胞因子級聯(lián)反應，促進其他細胞因子的產(chǎn)生和釋放［7］。IL-6與膿毒癥發(fā)病關系密切，能誘發(fā)膿毒癥炎癥反應，激活凝血，導致循環(huán)不穩(wěn)定等病理生理過程，且與膿毒癥病情及預后密切相關［8］。PCT常用于評價膿毒癥患者嚴重程度、治療及預后，且與疾病的并發(fā)癥及死亡率相關［9］。

菌黃保腸合劑為昆明市中醫(yī)醫(yī)院專家團隊研制而成的院內(nèi)特色制劑，由黃芪、白術、茯苓、太子參、薏苡仁、炒黃連、神曲、茵陳、石菖蒲組成，具有健脾益氣、調(diào)節(jié)脾胃之功效。本方在四君子湯及黃芪四君子湯基礎上加減而成，加薏苡仁、黃連、神曲、茵陳、石菖蒲等芳香化濕健脾消積之品，寒溫并用，補瀉兼施，使脾胃功能進一步得到鞏固。膿毒癥患者正氣不足，加之毒邪乘虛侵襲，氣血津液逆亂，升降失常。脾胃為后天之本，易受外邪侵襲，毒邪郁于腸腑或傳入陽明，耗傷脾胃之氣，內(nèi)生濕熱、痰濁等病理產(chǎn)物。因此，在治療中，既要解毒通瘀，更要顧護脾胃，補益正氣，這是治療危重患者胃腸功能障礙的根本所在。菌黃保腸合劑通過健脾益氣可促進正氣恢復，兼以清熱利濕，祛除邪實，為標本兼治。

現(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪多糖能降低梗阻性黃疸大鼠組織TNF-α、IL-1β水平，減輕小腸組織病理損害［10］；茯苓多糖能降低胰腺炎大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平，減少小腸黏膜上皮損傷［11］；白術內(nèi)酯能抑制TNF-α、IL-6產(chǎn)生，白術多糖能修復大腸桿菌腹瀉模型小鼠腸道黏膜［12］；太子參可通過P13K/Akt信號通路降低1L-1β和IL-6水平，太子參多糖具有腸道保護作用［13］；黃連具有廣譜抑菌活性，可通過下調(diào)TNF-α mRNA水平而發(fā)揮抗炎作用，且黃連生物堿能對抗結腸炎大鼠的腸道黏膜損害［14］；薏苡仁提取物能抑制多種細菌生長，薏苡仁蛋白具有抗炎活性［15］；神曲能降低功能性消化不良大鼠血清TNF-α含量，增加有益菌群數(shù)量，抑制腸桿菌生長［16］；茵陳提取物能通過降低TNF-α、IL-4、IL-6水平而發(fā)揮抗炎作用，且具有良好的抑菌能力［17］；石菖蒲水提液具有一定的抗菌殺菌作用，其有效成分細辛醚具有抗炎作用，能抑制TNF-α和IL-1β表達［18］?？梢?，菌黃保腸合劑中大部分單味藥具有降低炎癥因子水平、抗菌消炎、保護腸道及調(diào)節(jié)腸道菌群等作用。

本研究顯示，菌黃保腸合劑組大鼠存活率明顯高于陽性對照組，說明菌黃保腸合劑能降低膿毒癥大鼠死亡率。陽性對照組及菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠結腸組織中大腸桿菌含量明顯減少，雙歧桿菌和乳酸桿菌含量明顯增加，說明雙歧桿菌腸溶膠囊與菌黃保腸合劑均能調(diào)整膿毒癥引起的腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌的降低和大腸桿菌的升高，但菌黃保腸合劑效果更明顯。陽性對照組及菌黃保腸合劑低、中、高劑量組大鼠血清PCT、TNF-α及IL-6表達水平明顯降低，且菌黃保腸合劑低、中、高劑量組降低更明顯，說明雙歧桿菌腸溶膠囊與菌黃保腸合劑均能降低膿毒癥大鼠血清炎癥因子PCT、TNF-α及IL-6水平，且菌黃保腸合劑效果優(yōu)于雙歧桿菌腸溶膠囊?？梢?，菌黃保腸合劑可能通過調(diào)整膿毒癥腸道菌群，防止細菌移位，同時降低膿毒癥血清炎癥因子水平，發(fā)揮雙重治療作用，從而更有效地發(fā)揮治療作用。本研究的創(chuàng)新在于采用菌黃保腸合劑治療膿毒癥腸道菌群紊亂，應用16SrDNA測序?qū)δc道組織菌群進行定量分析，明確了菌黃保腸合劑可以調(diào)節(jié)膿毒癥引起的腸道菌群紊亂，同時考慮到細菌移位后引發(fā)的全身炎癥反應，故同時檢測其炎癥因子水平。但中醫(yī)藥治療膿毒癥病因病機復雜，可能從多途徑、多靶點發(fā)揮作用。所以，菌黃保腸合劑治療膿毒癥的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，菌黃保腸合劑能調(diào)節(jié)膿毒癥所致的腸道菌群紊亂，降低血清炎癥因子水平，降低膿毒癥的死亡率，對膿毒癥起到治療作用。