病證結合型心肌缺血動物實驗模型的構建和評價?

李 紅 范增慧 譚穎穎△

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院，陜西 西安 710038）

心肌缺血是由于冠狀動脈硬化所致的一支或多支血管狹窄或冠狀動脈痙攣引起的血管不完全性閉塞，導致所供血部位的心肌暫時缺血（氧）［1］。冠狀動脈粥樣硬化是引起心肌缺血最主要的病因［2-3］。防治心肌缺血，研究有效的治療方法已成為心血管疾病臨床及實驗研究的熱點和難點。心肌缺血常見的心前區(qū)疼痛癥狀與中醫(yī)中“胸痹”“真心痛”相對應，胸痹為本虛標實之證，虛性病理因素以氣虛、陰虛為著，實性病理因素主要為血瘀、痰濁、氣滯、寒凝為著［4］。臨床中，中西醫(yī)結合最成功的經(jīng)驗是“病與證”的方法，即中醫(yī)的證與西醫(yī)的病相結合［5］，全面分析疾病發(fā)生發(fā)展，將中、西醫(yī)兩者治療優(yōu)勢互補，以達到最佳治療效果。對應在實驗中，構建兼有中西醫(yī)特色的病證結合動物模型則具有了重要意義，既能體現(xiàn)西醫(yī)的病理特點，又具有中醫(yī)的證候表現(xiàn)，在中醫(yī)臨床與基礎之間架起橋梁，是中醫(yī)實驗動物模型發(fā)展的新方向［6］。本文將實驗中常使用的制備心肌缺血模型的方法與建立符合中醫(yī)證候特點的模型制備方法相結合，歸納總結出具有心肌缺血病證結合特點的動物模型。

1 瘀血阻滯心脈

1.1 模型制備 心血瘀阻證多由于氣血運行不暢，血滯成瘀，閉阻心脈而成，臨床上以胸部刺痛，固定不移，入夜尤甚，舌質(zhì)紫黯，脈沉弦為主要表現(xiàn)［7］。

牟菲等［8］在建立胸痹心血瘀阻證大鼠模型時，采用冠狀動脈結扎術，并將血液流變學檢測結果結合血液“黏、聚、凝、稠”的改變作為心血瘀阻證的客觀指標。冠狀動脈結扎法即在胸骨左緣第3～5肋間開胸，結扎冠狀動脈左前降支，此法是最常用的復制急性心肌缺血的方法之一。孫維娜等［9］給中華小豬行冠脈造影及鈍緣支明膠海綿封堵術，導絲及動脈鞘管由右側(cè)股動脈處穿刺送入，最終將Runthrough微導管遠端送入OM支近端，推入明膠海綿混懸液，以中斷OM支遠端血流，用此法模擬急性心肌缺血狀態(tài)。冠狀動脈結扎術與明膠海綿封堵術兩者原理類似，意在直接阻斷心臟冠脈血流，造成心肌缺血缺氧。

1.2 模型評價 中醫(yī)理論中提到“瘀者，積血也”，當冠狀動脈管腔狹窄或阻塞，血流量減少，即為血運不暢，血運不暢屬“瘀”，為血瘀證［10］。按照上述方法所制備的動物模型具有符合血瘀證的一般表現(xiàn)，即精神萎靡，毛發(fā)失去光澤，大鼠鼻尖、口唇、掌心、舌面均發(fā)生不同程度的變紫變暗［11］，血液“黏、聚、凝、稠”的改變也符合血瘀證的血液特點。但此法需行開胸手術，創(chuàng)傷性大，死亡率相對較高。另外，此法造模是直接阻斷血液的機械流通，但中醫(yī)所表述的心血瘀阻證是由于久病體虛，或思慮勞心過度，以致心之陽氣不足，無力推動血液運行所致，相對比而言，難以準確把握造成心血瘀阻證的病因病機。

2 痰濁阻遏心氣

2.1 模型制備 痰濁閉阻多由于脾胃損傷，運化失健，聚濕生痰，上犯心胸，阻遏心陽，使氣機不暢，心脈閉阻所致。臨床上以胸悶痛，痰多氣短，肢體困重，頭暈嗜睡，倦怠乏力，大便黏膩不爽，舌苔厚膩，脈滑為主要表現(xiàn)［7］。

杜瑩等［12］在制備脾虛痰濁動脈粥樣硬化疾病模型時選用巴馬小型豬為實驗對象，采用高脂飼料結合冠脈機械損傷與跑步過勞的多因素復合方法，高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)，第2周時給予模型組行冠狀動脈機械損傷術，第6周開始使小型豬每日過勞跑步，至第24周造模結束。張成哲等［13］在研究益氣健脾方治療冠心病的作用機制時，給巴馬小型豬以高脂飼料喂養(yǎng)造模，并于第2周行冠脈結扎術以復制心肌缺血模型，在小型豬術后恢復后，給予隔日力竭游泳措施進行干預，連續(xù)10周。造模結束后小型豬出現(xiàn)精神萎靡、神疲、便溏、納差等表現(xiàn)，并通過電鏡及光鏡下觀察小型豬心肌組織，發(fā)現(xiàn)心肌細胞有壞死、水腫等表現(xiàn)，符合心肌缺血病理表現(xiàn)。

2.2 模型評價 以高脂飼料模擬肥甘厚膩之物，過食油膩之品傷及脾胃，運化失司，致使體內(nèi)膏脂積存過多，形成痰濁，使微血管阻塞，誘發(fā)心肌缺血?！皠趧t氣耗”“唯勞倦最能傷脾”，以跑步或游泳過勞模擬脾虛模型，給予痰濁形成的病理基礎，且有研究表明，過勞應激反應會損傷心肌細胞，影響心臟功能［14］。在痰濁閉阻模型制備中，絕大部分需要采用高脂飼料，高脂飼料配方中多有含量較高的豬油，適口性一般，動物在長期食用高脂飼料后易出現(xiàn)厭食情況，影響造模結果，且定制高脂飼料價格昂貴，對于經(jīng)費要求較高。

3 氣機壅滯心胸

3.1 模型制備 氣滯心胸證多由于情志不暢，肝失疏泄，氣機郁滯所致，臨床上以心胸滿悶，陣陣隱痛，痛有定處，時欲太息，遇情志不遂時容易誘發(fā)或加重，苔薄，脈細弦為主要臨床表現(xiàn)［7］。

賴瀟筱［15］根據(jù)腎上腺素增多與焦慮不安、煩躁、暴怒等情緒密切相關，選取健康雄性SD大白鼠，多次腎上腺素皮下注射，以此誘發(fā)焦慮狀態(tài)，模擬情志變化，再結合冰水刺激。后經(jīng)檢測血流動力學提示平均血流量明顯下降，血液流變學提示紅細胞聚集指數(shù)明顯增加、全血黏度明顯增高，血清檢測指標CK-MB、LDH、NO含量顯著增高。符合“血瘀證”模型表現(xiàn)。除了使用藥物造模，也有研究者采用外界刺激方法，觸怒動物，使動物長期保持暴怒或驚恐狀態(tài)，以達到肝郁氣滯，進而演化為氣滯血瘀。許穎智等［16］利用不可預知的多種應激隨機組合方法刺激大鼠，如24 h晝夜失調(diào)刺激、黑暗時燈光閃爍刺激、冰水站立刺激、夾尾激惹刺激等，致使大鼠情志異常，并于2周后行冠狀動脈結扎術。造模結束后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠情緒過激易怒，攻擊性強。實驗室檢測示血小板聚集率升高，心肌組織病理學結果顯示大面積梗死區(qū)域。郭文鶴等［17］運用“寒凝則氣滯”這一理論，復制寒、氣、血、瘀相互影響、相互作用的病理狀態(tài)，從而構建出冠狀動脈粥樣硬化氣滯血瘀證病證結合動物模型。

3.2 模型評價 近年來，研究者多從動物情志方面入手，給予藥物注射，使體內(nèi)血流直接呈現(xiàn)出過激情緒后的狀態(tài)，或是給予外界刺激，通過影響動物情志，刺激機體內(nèi)環(huán)境改變，然后根據(jù)西醫(yī)檢測指標和中醫(yī)證候特點分析驗證造模是否成功。也有研究者著重制造具有病理因素的環(huán)境（通常為寒冷環(huán)境），依據(jù)中醫(yī)理論中疾病發(fā)展的規(guī)律及病理因素間的相互作用，最終轉(zhuǎn)化為氣滯血瘀證。

4 陰寒凝滯血脈

4.1 模型制備 寒凝血脈證多由于素體陽虛，感受寒邪，陰寒凝滯，閉阻心脈所致。臨床上以心痛如絞，心痛徹背，遇冷疼痛加重，伴手足不溫，心悸氣短，苔白脈緊為主要特點［7］。

王朋等［18］選擇單一藥物因素造模的方法，先制造西醫(yī)疾病模型，不施加人為干預，再依據(jù)對動物模型的觀察以及實驗室檢查結果，判定動物模型的中醫(yī)屬性。他們給予SD大鼠股靜脈注射垂體后葉素6 U/kg（質(zhì)量濃度2 U/mL），5 s恒速注射完畢，注射后30 min內(nèi)通過觀察大鼠一般情況、體征、心電圖、微靜脈管徑及紅細胞流速以及血漿血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列環(huán)素F1α（6-Keto-PGF1α），發(fā)現(xiàn)大鼠符合冠脈痙攣性心絞痛動物模型指標，且其一般表現(xiàn)與體征符合中醫(yī)寒凝血脈證的病證特點。由此他們推斷垂體后葉素大劑量造模具有明顯的寒邪致病特點，采用該法可成功建立大鼠冠心病心絞痛寒凝血瘀證模型。趙姍姍等［19］在優(yōu)化寒凝血瘀證動物模型造模方法時，采用全身冷凍法造模，將SD大鼠每日放入-20℃低溫冰柜中受凍1 h，并得出結論大鼠連續(xù)冷凍14 d為最優(yōu)時間，造模效果最佳。楊延澤等［20］在制備寒凝血瘀證大鼠模型時采用藥物加寒凝法造模，模型組大鼠皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素注射液0.8 mL/kg，再置于0～2℃冰水中游泳4 min，2 h后再次皮下注射等量0.1%鹽酸腎上腺素，8 d后血液流變學提示全血黏度明顯增高，心臟血流動力學提示心率增快，左心室收縮壓顯著降低。另外血小板聚集增強、血細胞比容顯著增高，驗證造模成功。李馳坤等［21］在制備冠心病心肌缺血寒凝血瘀證大鼠模型時采用藥物加寒凝法造模，將模型組大鼠每日置于-15℃低溫冰柜1 h，連續(xù)6周，并在最后3 d連續(xù)每日腹腔注射垂體后葉素20 U/kg，造模結束后監(jiān)測大鼠肛溫明顯降低，心電圖J點位移明顯增加，TXB2升高、6-Keto-PGF1α下降，證明該造模方法可行。

4.2 模型評價 研究者們在制備寒凝血瘀證模型中，利用“寒性收引，寒邪易傷陽氣”的中醫(yī)理論，使實驗動物接受長期的外界低溫環(huán)境刺激，以致血脈運行不暢通，進而出現(xiàn)瘀滯。除去寒戰(zhàn)、打噴嚏、流涕、唇爪耳尾色青紫、大便濕爛等體征的改變，結合現(xiàn)代醫(yī)學檢測手段，以心電圖示J點（QRS波群的終點與ST段交接處）的位移顯著變化［18］和紅細胞變形指數(shù)、血漿黏度、凝血功能測定以及TSH、ET、NO作為寒凝血瘀證模型成功復制的評價指標［19-20］。

但有研究者發(fā)現(xiàn)若采用低溫環(huán)境刺激法（將大鼠每日放在-20℃低溫冰柜中受凍1 h），在造模7 d時，ET、NO以及血流變指標有明顯變化，而20 d后這些檢測結果卻趨于正常［19］。由此推斷在受到規(guī)律的長期刺激后，大鼠對于寒冷環(huán)境產(chǎn)生適應性反應，故認為以此等方法造模只能使血液暫時性的表現(xiàn)為黏、凝狀態(tài)，并不能完全復制中醫(yī)所述的“血瘀證”。

5 心氣陰血兩虛

5.1 模型制備 氣陰兩虛證是由心氣不足，陰血虧耗，血行瘀滯所致。臨床上以胸悶隱痛，時作時止，心悸氣短，動則益甚，倦怠懶言，聲息低微，易汗出，頭暈目眩，遇勞則甚，舌偏紅或有齒印，苔薄白，脈細弱無力，或結代為主要特點［7］。

莊先飛等［22］采用慢性間歇性缺氧復合異丙腎上腺素的方法建立氣陰兩虛心血管疾病模型，將小鼠放入氧分壓為7%～8%的低壓氧儀中持續(xù)缺氧20 min，連續(xù)14 d，第15日于尾靜脈注射異丙腎上腺素5 mg/kg，經(jīng)檢測模型小鼠心電圖T波抬高，心臟B超示左心室射血分數(shù)顯著升高，血清中CK-MB以及hs-CPR明顯升高，也出現(xiàn)了形體消瘦，食欲不振，體倦乏力，煩躁等符合氣陰兩虛證特點的表現(xiàn)。馬慕秾等［23］建立氣陰兩虛模型時把握中醫(yī)理論中傷陰耗氣的病理因素，采用食燥熱之品、限食加負重游泳三因素結合法，給予燥熱藥物灌胃，減少飲食為正常量的30%，且每日間強迫大鼠負重游泳，強度以大鼠力竭為標準，6周后模型建立成功。鐘森杰等［24］則在建立心氣陰兩虛模型時，采用“以方測證”法，首先建立心衰大鼠模型，再將大鼠分組給予藥效完全相反的藥物，給藥周期結束后，對比各組大鼠檢測結果，發(fā)現(xiàn)服用補益氣陰藥物組大鼠治療效果顯著，即判定所造模型屬氣陰兩虛模型。

5.2 模型評價 氣虛則無以行血，陰虛則脈絡不利。以大鼠每日高強度運動給予“體勞”刺激，以每日被迫游泳，剝奪睡眠時間給予“神勞”刺激，基于“勞則氣耗”“過勞傷陰”這一理論，建立氣陰兩虛模型［25-26］。另外大鼠長期“熬夜”，以致陰陽氣血失和，營衛(wèi)失調(diào)，會加重了氣陰兩虛表現(xiàn)［27］。但在既往研究者造模過程中，不論是給予實驗動物模擬缺氧環(huán)境還是每日強制過勞運動，都重點突出了導致氣虛的致病因素，未能明確呈現(xiàn)模擬陰虛的應激源。

6 討 論

總結近年來構建病證結合動物模型的方法，大致分有4類：第1類，先建立現(xiàn)代醫(yī)學概念中的疾病，在疾病的基礎上復制符合中醫(yī)特點的證候模型。第2類，先根據(jù)證候的形成特點復制出證候模型，再依據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學病理概念制作疾病模型［28］。第3類，確定某種方法制備現(xiàn)代醫(yī)學的疾病模型，不加以人為干預，觀察該模型的一般表現(xiàn)、行為特點以及實驗室檢查等，判定該模型所屬證候類型。第4類，“以方測證”，先建立疾病模型，再選用臨床價值較高的經(jīng)方，分析服藥后的治療效果，確定是否方證相對，以判斷模型所屬證型［29］，或建立證候模型后，選用功效不同甚至相悖的經(jīng)方分組治療，對比各組治療結果，判斷模型建立是否成功［30-31］。其中前兩類造模方法是目前實驗研究過程中最常用的方法，以期達到疾病共性規(guī)律與個體個性特征的有機結合［28］。

中醫(yī)證候動物模型作為中醫(yī)學實驗研究的主要載體，其造模水平高低將直接影響到中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進程［32］，但是建立病證結合動物模型迄今為止還未成熟，現(xiàn)在所用的造模方法都有一定局限性。1）缺失中醫(yī)的主導性。構建具有中醫(yī)證候特色的動物模型，從本質(zhì)上講就是最大限度還原患者的臨床特征，再給予藥物治療，檢測中藥方劑對于某一疾病的治療療效。所以動物模型是將中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學相結合的橋梁。但目前，在制作動物模型過程中缺失中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學關聯(lián)，大部分的造模過程只能根據(jù)成型的中醫(yī)理論盡可能地去模擬動物的飲食或生存環(huán)境，中醫(yī)處于輔助地位，失去了指定疾病發(fā)展方向的主動性。2）在選擇實驗對象時缺乏統(tǒng)一性。建立同樣的證候模型在不同的實驗中可能選擇了不同的實驗動物。不同種屬的實驗動物對于各因素的反應可能有質(zhì)的不同，即使是同一種屬、不同種系的實驗動物面對同一刺激產(chǎn)生的反應也會有很大差異［33］。因此在構建病證結合動物模型時，尚不能明確可以排除由實驗對象的不同所帶來的結果差異。3）在制作動物模型的手段上缺乏針對性。在一些造模過程中，陽虛證［34］與寒凝證都采用短時期的低溫環(huán)境刺激法，而虛、實病證從中醫(yī)理論的病因病機角度來說有很大差別，即便隨著病情演變，兩者之間可相互轉(zhuǎn)化，也需要一定的時間或轉(zhuǎn)化條件，但目前實驗造模周期普遍較短，在造模過程中沒有明確的理化標準去判定模型證候建立是否達到一定的標準，對于研究者所認為的實驗動物在造模后出現(xiàn)的行為改變，如倦怠、萎靡等，只能是研究者根據(jù)實驗動物的一般表現(xiàn)做出的主觀判定。也有研究者提出將病證結合動物模型的造模結果用西醫(yī)實驗室檢查結果規(guī)范化統(tǒng)一，如將血液中cAMP/cGMP比值、Na+-K+-ATPase和SOD水平的降低對應于氣陰虛證的指征［35］。4）多因素造模時缺乏邏輯性。在有些造模過程中會采用多因素組合刺激實驗動物，使得干預實驗動物的因素過于復雜，受控程度變差，不能明確各個因素之間是否相互影響，亦不能明確各因素對結果是否有消極影響，這一點缺乏邏輯性。

構建病證結合動物模型現(xiàn)在有了一定的實驗基礎，但還沒有完整的體系，研究者們也處于探索時期，本文從心肌缺血模型入手，對近年常用造模方法進行綜述，以期對病證結合動物模型的構建有所幫助。