針刀干預(yù)對(duì)中期膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨壓縮力學(xué)性能的影響?

王軍美 秦露雪 陳烯琳 鐘紅剛 劉 聰 尹孟庭 郭長青△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100020）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化或囊性變、滑膜病變?yōu)橹饕±碜兓⑸婕跋ブ苘浗M織病變的全關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于中老年人，以膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)［1］。中國KOA的患病率和致殘率高，疾病負(fù)擔(dān)重，嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量［2］。人口老齡化的趨勢(shì)導(dǎo)致KOA的發(fā)病率逐年上升。既往研究多關(guān)注于軟骨層面，自RADIN等［3］首次提出軟骨下骨的厚度、硬度的改變可誘導(dǎo)軟骨退變后，軟骨下骨在KOA的研究中得到更多的關(guān)注。膝關(guān)節(jié)力學(xué)失衡是KOA發(fā)病的重要誘因。其中軟骨下骨力學(xué)性能的改變?cè)贠A的發(fā)病及進(jìn)展中的作用不容忽視。在膝關(guān)節(jié)應(yīng)力傳導(dǎo)中，軟骨下骨具有一定的強(qiáng)度以支撐軟骨，并富有一定的彈性以緩沖大部分機(jī)械應(yīng)力以保護(hù)軟骨，維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定［4］。異常應(yīng)力下，軟骨下骨發(fā)生異常重塑導(dǎo)致自身生物力學(xué)性能受損，保護(hù)軟骨功能減弱，加速軟骨退變及KOA進(jìn)展。將軟骨下骨作為治療KOA的新靶點(diǎn)，解除膝關(guān)節(jié)異常應(yīng)力，通過抑制軟骨下骨重塑改善軟骨下骨力學(xué)性能來治療KOA不失為一種新思路。

針刀力學(xué)效應(yīng)可以調(diào)整膝關(guān)節(jié)力學(xué)失衡，前期已經(jīng)證明針刀通過“調(diào)筋”恢復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)良性應(yīng)力改善軟骨退變［5-6］，但針刀對(duì)軟骨下骨的力學(xué)性能是否有調(diào)控作用，尚未闡明。因此，本研究通過對(duì)軟骨下骨壓縮力學(xué)性能的觀察，旨在以軟骨下骨為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)一步探討針刀治療KOA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康6月齡雄性新西蘭兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0010。于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室（SPF級(jí)）分籠飼養(yǎng)，室溫（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h/12 h明暗周期，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食飲水。

1.2 試劑與儀器

戊巴比妥鈉（北京百諾威生物科技有限公司）；多聚甲醛（北京化學(xué)試劑公司）；EDTA溶液（北京化學(xué)試劑公司）；Fast green FCF、Safranine O（美國Sigma公司）；醫(yī)用壓敏膠帶（寬0.9 cm，青島海諾生物工程有限公司）；泡沫雙面膠（厚10 mm，上海得力文具有限公司）；樹脂繃帶（150 mm×1 800 mm，衡水廉潔醫(yī)療器械有限公司）；高分子繃帶（150 mm×3 600 mm，蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司）；一次性針刀（0.3 mm×30 mm，北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司）；一次性無菌針灸針（0.20 mm×13 mm，環(huán)球牌，蘇州針灸用品有限公司）；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（LH202H，北京華為產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司）；電子萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（WD-1，長春非金屬試驗(yàn)機(jī)場(chǎng)）；光學(xué)顯微鏡（BX53，日本奧林巴斯公司）。

1.3 分組與造模

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、模型組、針刀組和電針組，每組6只。兔禁食10～16 h，由耳緣靜脈處按30 mg/kg劑量注射3%戊巴比妥鈉溶液，待兔麻醉起效后，牽拉使其左后肢膝關(guān)節(jié)處于伸直位，采用改良后的Videman法［7］固定制動(dòng)制備KOA模型。第1層，壓敏膠帶整體覆蓋包裹住膝蓋，確保任何粘有兔毛的膠帶都不會(huì)脫落，將雙面泡沫膠纏繞覆蓋壓敏膠帶；第2層，在足踝部、膝關(guān)節(jié)下方和腹股溝處纏繞一層脫脂棉墊，防止樹脂繃帶與皮膚產(chǎn)生摩擦；第3層纏繞樹脂繃帶，從腹股溝至足踝部固定；第4層纏繞高分子繃帶，在末端貼上醫(yī)用膠紙，留出足趾觀察血供。最后再纏繞一層防啃咬繃帶，同樣用醫(yī)用膠紙固定，防止兔的啃咬破壞，共制動(dòng)9周。倫理審查機(jī)構(gòu)：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，批準(zhǔn)號(hào)：AN001-T01-2019C005。

1.4 干預(yù)方法

各組均拆除樹脂固定1周后進(jìn)行干預(yù)。1）空白組：正常飼養(yǎng)3周，每天同干預(yù)組一樣抓取、捆綁固定。2）模型組：造模后每天同干預(yù)組一樣抓取、捆綁固定，共3周。3）針刀組：龍膽紫定位后備皮、消毒，采用0.3 mm×30 mm一次性針刀刺入兔左后肢股內(nèi)、外側(cè)肌腱止點(diǎn)，股直肌肌腱止點(diǎn)，股二頭肌肌腱止點(diǎn)和鵝足腱囊，針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚垂直刺入，向肌腱與骨的連接方向進(jìn)行松解，出刀后按壓止血，治療每周1次，共3周。4）電針組：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［8］取穴，采用0.20 mm×13 mm一次性無菌針灸針刺入兔左后肢曲泉、委陽、內(nèi)膝眼、外膝眼并施以平補(bǔ)平瀉法得氣后，韓氏穴位神經(jīng)刺激儀設(shè)定波形疏密波、2/100 Hz頻率、3 mA強(qiáng)度行電針刺激，分別連接曲泉與委陽、內(nèi)膝眼與外膝眼，每次15 min，治療隔天1次，共3周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 取材 治療結(jié)束1周后，將各組兔麻醉后致死，在無菌條件下打開膝關(guān)節(jié)腔，除去髕骨下滑膜、韌帶、半月板等，暴露關(guān)節(jié)軟骨，采用環(huán)鉆垂直于兔左下肢脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)中央負(fù)重區(qū)截取直徑8 mm、高度10 mm的軟骨-軟骨下骨復(fù)合體圓柱形組織塊。

1.5.2 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將軟骨-軟骨下骨復(fù)合體圓柱形組織塊置于4%多聚甲醛固定72 h后，置于15%中性EDTA-2Na脫鈣兩周，再梯度脫水、石蠟包埋、作厚度為5 μm的連續(xù)切片。切片采用番紅O/固綠染色，以便觀察軟骨及軟骨下骨病理形態(tài)，參照Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)軟骨退變程度進(jìn)行評(píng)分［9］和病理分期［10］，1～5分為早期骨關(guān)節(jié)炎，6～9分為中期骨關(guān)節(jié)炎，10～14分為晚期骨關(guān)節(jié)炎。

1.5.3 軟骨下骨壓縮力學(xué)測(cè)試 1）標(biāo)本處理：將骨組織的關(guān)節(jié)軟骨以銳刀切下，直至顯露出軟骨下骨，采用低速骨鋸平行鋸切圓柱試件端面直至骨面光滑平整，在脛骨平臺(tái)負(fù)重區(qū)找準(zhǔn)位置后，采用金剛石環(huán)鉆取高度為3 mm、直徑為4 mm的圓柱形骨柱。2）圓柱形骨柱尺寸測(cè)試：采用精度0.01 mm的厚度儀測(cè)量圓柱形骨柱的原始高度L0。采用精度0.01 mm電子卡尺測(cè)試圓柱形骨柱的直徑d，分別在上、中、下3個(gè)水平，每個(gè)水平每隔60°測(cè)試1次，共9次取平均值，全部測(cè)量均由一名研究者完成以減少誤差，根據(jù)直徑d計(jì)算圓柱形骨柱的原始截面積S0。3）壓縮測(cè)試：采用長春非金屬試驗(yàn)機(jī)場(chǎng)生產(chǎn)的WD-1材料試驗(yàn)機(jī)，設(shè)定加載速度2 mm/min，傳感器量程500 N。各標(biāo)本按加載位移分級(jí)測(cè)試多次，記錄初次出現(xiàn)屈服峰的那次測(cè)試的載荷-位移曲線，記錄最大位移ΔL、最大載荷F、其線性部分（一般取曲線上最大載荷的20%和80%的點(diǎn)連線）斜率k。將所得最大載荷F、標(biāo)本原始截面積帶入壓縮強(qiáng)度σ計(jì)算公式：

將所得曲線斜率k、標(biāo)本原始截面積S0、標(biāo)本原始高度L0代入彈性模量E計(jì)算公式：

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS21.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示。所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)、Levene′s test方差齊性檢驗(yàn)。滿足正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；否則采用Krus?kal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

實(shí)驗(yàn)過程中，各組兔無死亡和感染情況，共24只兔可進(jìn)入分析。

2.2 組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 各組兔軟骨-軟骨下骨復(fù)合體染色光鏡結(jié)果 空白組軟骨層基質(zhì)被蕃紅O染色，呈均勻紅色，結(jié)構(gòu)完整、厚度正常，潮線清晰而完整，軟骨細(xì)胞規(guī)律排列，無軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，無血管翳生成。軟骨下骨被固綠染成藍(lán)色，軟骨下骨板厚度正常。模型組軟骨層基質(zhì)淡染，軟骨層明顯變薄，軟骨細(xì)胞排列紊亂，呈現(xiàn)肥大增殖、簇集現(xiàn)象，潮線缺損，破壞甚至消失，軟骨下骨板厚度明顯增加。針刀組、電針組軟骨細(xì)胞排列較為規(guī)則，層次可分，細(xì)胞輕度增生，部分區(qū)域有簇集現(xiàn)象，潮線尚完整，稍有或未有血管翳生成，軟骨下骨板輕度增厚。見圖1。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)蕃紅O/固綠染色圖（40倍）

2.2.2 各組兔軟骨Mankin評(píng)分 造模后，模型組Mankin評(píng)分較空白組顯著升高（P<0.01）。經(jīng)針刀、電針干預(yù)后，兩組Mankin評(píng)分較模型組顯著降低（P<0.01），針刀組Mankin評(píng)分較電針組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。中期骨關(guān)節(jié)炎的Mankin評(píng)分為6～9分，模型組6個(gè)樣本的Mankin評(píng)分均在6～9分之間，符合中期骨關(guān)節(jié)炎的病理改變。

表1 各組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分比較（分，±s）

注：與空白組比較，?P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與電針組比較，#P<0.01。下同。

Mankin評(píng)分0 8.17±0.75*3.33±1.03*△△#5.17±1.17*△△組別空白組模型組針刀組電針組n6 6 6 6

2.3 軟骨下骨壓縮力學(xué)性能測(cè)試

見表2。與空白組相比，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強(qiáng)度和彈性模量顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，針刀組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強(qiáng)度、彈性模量顯著升高（P<0.01或P<0.05）；電針組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強(qiáng)度和彈性模量顯著升高（P<0.05）。針刀組與電針組相比，軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強(qiáng)度和彈性模量上升，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但針刀組趨勢(shì)更接近正常組。

表2 各組兔軟骨下骨壓縮力學(xué)性能參數(shù)比較（±s）

表2 各組兔軟骨下骨壓縮力學(xué)性能參數(shù)比較（±s）

組別空白組模型組針刀組電針組n 6 6 6 6最大位移（mm）0.22±0.01 0.18±0.01*0.21±0.01△△0.20±0.01△最大載荷（N）161.25±17.62 117.03±17.24*145.71±15.82△140.03±19.24△壓縮強(qiáng)度（MPa）12.51±1.07 9.57±1.40*11.52±1.11△11.22±1.21△壓縮模量（MPa）317.21±20.54 268.13±12.28*312.50±23.43△297.58±26.01△

3 討 論

膝關(guān)節(jié)力學(xué)失衡是KOA發(fā)生發(fā)展的重要誘因。本研究采用改良后的Videman法左后肢伸直位固定制動(dòng)造模，能復(fù)制出因膝關(guān)節(jié)力學(xué)失衡導(dǎo)致的KOA模型，通過限制兔膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)，使膝周軟組織收縮，直接增加關(guān)節(jié)軟骨的壓力，膝關(guān)節(jié)應(yīng)力異常，關(guān)節(jié)軟骨破壞，加速KOA的形成［10］。造模后，模型組兔膝關(guān)節(jié)番紅O/固綠染色顯示軟骨結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，出現(xiàn)典型病理退變，Mankin評(píng)分較空白組明顯升高。本研究在軟骨退變的基礎(chǔ)上，還觀察到制動(dòng)造模使KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨層明顯變薄、軟骨下骨板明顯增厚。

軟骨下骨與軟骨在OA的發(fā)病及進(jìn)展過程中互為因果。軟骨-鈣化軟骨-軟骨下骨組成的骨單元是膝關(guān)節(jié)重要的應(yīng)力傳導(dǎo)系統(tǒng)，軟骨下骨富有一定的強(qiáng)度（承載負(fù)荷而自身不被破壞的能力）和彈性（外力作用下抵抗變形的能力），在生理負(fù)重情況下，軟骨下骨的力學(xué)功能為吸收、緩沖來自軟骨的應(yīng)力，并將應(yīng)力負(fù)荷向下及關(guān)節(jié)周圍組織傳遞，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨［11］。軟骨下骨能通過骨重塑——由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成處于動(dòng)態(tài)平衡而維持了軟骨下骨骨量和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，來不斷適應(yīng)力學(xué)環(huán)境的變化。異常應(yīng)力下，軟骨下骨骨吸收/骨形成失衡，表現(xiàn)為異常的骨重塑，通常伴有生物力學(xué)性能的下降。軟骨下骨承擔(dān)載荷和抗變形的能力下降，將減弱其緩沖震蕩的能力，可使上覆的軟骨受到異常的剪切力和張力，導(dǎo)致繼發(fā)性軟骨損傷和退變，在軟骨受到損傷后，又反作用于下面的軟骨下骨造成應(yīng)力增加、損傷加重，最終形成一個(gè)惡性循環(huán)［12］。由此可見，軟骨下骨的生物力學(xué)性能對(duì)KOA的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。通過抑制軟骨下骨異常重塑改善軟骨下骨力學(xué)性能，是治療KOA的潛在靶點(diǎn)。

壓縮試驗(yàn)是測(cè)試骨組織力學(xué)性能的代表性方法之一。骨組織受力（載荷）則會(huì)變形（位移），壓縮強(qiáng)度代表物體在承擔(dān)負(fù)荷的情況下抵抗破壞的能力，彈性模量代表在應(yīng)力作用下抵抗變形的能力。壓縮力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，中期膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強(qiáng)度和彈性模量顯著降低，軟骨下骨的強(qiáng)度和彈性顯著下降，說明其力學(xué)性能受損，骨質(zhì)量下降，軟骨下骨產(chǎn)生退變。董啟榕等［13］復(fù)制兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型發(fā)現(xiàn)OA的各個(gè)階段都出現(xiàn)軟骨下骨力學(xué)性能的異常，其硬度和強(qiáng)度會(huì)呈現(xiàn)先降低然后逐漸增高的趨勢(shì)。軟骨下骨的力學(xué)性能取決于骨量、骨質(zhì)、骨小梁結(jié)構(gòu)排列以及材料成分（礦物和膠原蛋白）［14］。早期軟骨下骨力學(xué)性能下降與高活性狀態(tài)的骨吸收導(dǎo)致軟骨下骨骨質(zhì)疏松、骨小梁變薄、骨板厚度減少有關(guān)［15］。隨著疾病的發(fā)展，骨形成活躍導(dǎo)致骨量凈增加，軟骨下骨的骨體積增加，軟骨下骨骨小梁的形態(tài)由棒狀轉(zhuǎn)變成板狀，骨小梁厚度增加，這在影像學(xué)檢查中被視為骨硬化，軟骨下骨力學(xué)性能逐漸增高，但骨轉(zhuǎn)換率異常增高會(huì)伴隨新生的骨組織礦化不全，導(dǎo)致骨小梁雖然更厚但更少的情況，實(shí)際上軟骨下骨的生物力學(xué)特性減弱［12］。

KOA是一種筋骨共病、痿痹共存的疾?。?］。在發(fā)病機(jī)理方面，“經(jīng)筋”先遭受病因的侵襲，“宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)”（《素問·痿論》）的生理功能喪失累及膝“骨”，導(dǎo)致筋骨共病的結(jié)果。針刀作為KOA治療的有效方法之一被2020年版《膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療指南》推薦［1，16］。針刀治療KOA除了能有效地鎮(zhèn)痛、抗炎，其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于通過對(duì)粘連、攣縮的組織進(jìn)行松解以恢復(fù)膝關(guān)節(jié)力學(xué)平衡，改善膝關(guān)節(jié)功能受限問題。其通過對(duì)膝周韌帶、肌腱及髕骨內(nèi)外支持帶等進(jìn)行松解，改善肌肉-肌腱生物力學(xué)特性，發(fā)揮調(diào)筋作用，通過“調(diào)筋”恢復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)良性應(yīng)力，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成代謝，保護(hù)軟骨即發(fā)揮“治骨”作用［5-6］。經(jīng)針刀、電針干預(yù)后，軟骨染色情況改善，Mankin評(píng)分顯著降低，說明針刀、電針對(duì)KOA兔軟骨損傷有保護(hù)作用，且針刀效果優(yōu)于電針；軟骨下骨的最大位移、最大載荷、壓縮強(qiáng)度、彈性模量顯著降低，說明針刀干預(yù)可以改善軟骨下骨承擔(dān)載荷和抗變形的能力，且針刀和電針相比，針刀組的力學(xué)性能改善情況更好。其機(jī)制可能是針刀力學(xué)效應(yīng)抑制了軟骨下骨異常重塑從而改善了軟骨下骨的力學(xué)性能。

綜上所述，針刀干預(yù)可改善KOA兔軟骨下骨的壓縮力學(xué)性能，從而延緩KOA進(jìn)程。但本實(shí)驗(yàn)仍存在不足，壓縮力學(xué)性能只能宏觀地反映軟骨下骨的骨量和骨質(zhì)水平，而缺少對(duì)軟骨下骨骨量、骨質(zhì)以及微觀結(jié)構(gòu)變化的觀察，在今后的實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步通過影像學(xué)的指標(biāo)觀察諸如X光片、Micro-CT等，以期能更充分地、更深入地探討針刀干預(yù)KOA對(duì)軟骨下骨結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用。