柴胡皂苷B2對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響研究?

余莉萍 余淑菁 李旭成 崔金濤 陸佳鑫

（1.湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2.湖北省武漢市優(yōu)撫醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

膿毒癥是由于感染導(dǎo)致機(jī)體反應(yīng)異常引發(fā)的全身炎性反應(yīng)綜合征，發(fā)病過程迅速，于2017年被世界衛(wèi)生組織列為全球衛(wèi)生重點(diǎn)防治疾?。?］。膿毒癥能引發(fā)機(jī)體內(nèi)多種器官的感染，如肺損傷、腦膜炎、膽管炎等，其中肺損傷是常見的并發(fā)癥，且膿毒癥急性肺損傷具有較高發(fā)病率、病死率，盡管膿毒癥急性肺損傷的相關(guān)研究已有所進(jìn)展，但是病死率仍高達(dá)30%左右［2-3］。脂多糖（LPS）是細(xì)菌外膜的關(guān)鍵成分，也是誘發(fā)多種疾病的致病因素，常用來構(gòu)建膿毒癥急性肺損傷模型［4］。柴胡皂苷B2是從中藥柴胡內(nèi)提取的活性成分，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明具有抗炎、抗氧化、保護(hù)肝臟等多種藥理活性［5］。有研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷B2能夠減輕LPS/氨基半乳糖誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的氧化應(yīng)激和炎性損傷，改善肝臟的能量代謝［6］，但是對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷的研究尚不明確。本研究采用LPS誘導(dǎo)建立膿毒癥急性肺損傷模型，觀察柴胡皂苷B2對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)清潔級(jí)SD大鼠50只，雌性各半，體質(zhì)量（200±20）g，8周齡，購買中國食品藥品檢定研究院，許可證號(hào)為：SCXK（京）2012-0068。大鼠飼養(yǎng)于無病原菌的環(huán)境內(nèi)，溫度為22～25℃，濕度為50%～65%。

1.2 試劑與儀器 LPS購于美國Sigma公司；柴胡皂苷B2購于成都曼思特生物公司，純度>99%；TUNEL試劑盒、BCA試劑盒、顯色劑購于碧云天生物；B淋巴細(xì)胞瘤（Bcl-2）抗體、Bcl-2同源二聚體X蛋白（Bax）抗體、p53抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于美國Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒購于Diaclone公司。

1.3 造模與分組 將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型組和柴胡皂苷B2低、中、高劑量組。除空白對(duì)照組外，其余大鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS建立急性肺損傷模型。

1.4 給藥方法 造模6 h后，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔注射柴胡皂苷B2藥液5、10、20 mg/kg；空白對(duì)照組和模型組注射2 mL的生理鹽水。連續(xù)給藥7 d后，采用戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）肺組織濕干比。處死大鼠后，取出右葉肺組織，使用濾紙擦拭干凈水分，然后稱重。隨后置于70℃烘箱內(nèi)24 h稱取質(zhì)量，用于測(cè)定肺組織濕干比。肺組織濕干比=（濕重-干重）/干重×100%。2）TUNEL染色檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡。收集大鼠部分左葉肺組織，經(jīng)過石蠟包埋制成切片后，加入乙醇、二甲苯清洗，室溫下加入20 μg/mL蛋白酶K反應(yīng)15 min，PBS清洗，加入內(nèi)源過氧化氫酶滅活5 min，利用PBS清洗，加入Tunel試劑，加入DAB顯色液孵育10 min，利用乙醇、二甲苯脫水，用中性樹膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察Tunel染色情況，然后計(jì)算細(xì)胞凋亡率。3）Western blotting檢測(cè)肺組織Bcl-2、Bax、p53蛋白表達(dá)。收集各組部分左葉大鼠肺組織，加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解，然后提取各組的總蛋白，利用BCA試劑盒檢測(cè)定量蛋白濃度。然后將蛋白煮沸5 min，取35 μg上樣蛋白，用8%的分離膠和4%的濃縮膠處理蛋白樣品，蛋白樣品轉(zhuǎn)膜，封閉在5%脫脂奶粉內(nèi)60 min，加入Bcl-2、Bax、p53、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min，加入顯色劑用于顯色、顯影。使用Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)量。4）ELISA檢測(cè)血清SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。處死大鼠后，收集肺組織周圍血清5 mL，4℃下2 000 r/min離心10 min，離心半徑為3 cm，并收集各組的上清液，然后按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測(cè)各組SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)間比較用LSD法比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率的比較 見表1。與空白對(duì)照組相比，模型組內(nèi)肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率顯著增高（P<0.05）；與模型組相比，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組內(nèi)肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內(nèi)肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內(nèi)肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表1 各組大鼠肺組織濕干比及細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，?P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與柴胡皂苷B2低劑量組比較，△P<0.05；與柴胡皂苷B2中劑量組比較，&P<0.05。下同。

組 別n 肺組織濕干比 細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組10 10 10 10 10 12.30±1.93 31.18±3.14*27.10±2.47#23.39±1.88#△16.71±1.49#△&7.21±0.67 32.46±3.43*26.78±2.72#20.33±2.18#△12.21±1.42#△&

2.2 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 見圖1，表2。與空白對(duì)照組相比，模型組內(nèi)Bax、p53蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。與模型組相比，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組內(nèi)Bax、p53蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內(nèi)Bax、p53蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內(nèi)Bax、p53蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05）。

圖1 各組肺細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠肺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組n 10 10 10 10 10 Bcl-2 0.67±0.06 0.31±0.03*0.39±0.04#0.46±0.04#△0.55±0.04#△&Bax 0.26±0.02 0.73±0.05*0.59±0.04#0.46±0.04#△0.37±0.03#△&p53 0.27±0.03 0.68±0.06*0.56±0.05#0.47±0.04#△0.35±0.03#△&

2.3 各組大鼠血清內(nèi)氧化應(yīng)激水平的比較 見表3。與空白對(duì)照組相比，模型組內(nèi)SOD活性、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著增加（P<0.05）。與模型組相比，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組內(nèi)SOD活性、GSH-Px活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內(nèi)SOD活性、GSH-Px活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內(nèi)SOD活性、GSH-Px活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。

表3 各組大鼠SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量比較（±s）

表3 各組大鼠SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量比較（±s）

組別空白對(duì)照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組n 10 10 10 10 10 SOD（U/L）131.23±12.09 67.29±5.42*75.78±6.78#92.32±8.52#△117.91±10.38#△&GSH-Px（U/L）87.31±6.60 35.43±3.19*43.52±4.06#55.43±3.81#△72.84±6.47#△&MDA（μmol/L）2.40±0.44 8.44±0.89*6.92±0.53#5.29±0.41#△3.67±0.22#△&

2.4 各組大鼠血清內(nèi)炎性因子水平的比較 見表4。與空白對(duì)照組相比，模型組內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低（P<0.05）。

表4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

組別空白對(duì)照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組n 10 10 10 10 10 TNF-α 85.38±7.21 215.89±18.40*177.45±15.32#134.22±11.48#△95.43±8.17#△&IL-1β 65.83±4.52 149.33±14.17*115.30±10.38#95.31±8.72#△74.81±6.78#△&IL-6 52.67±4.50 125.16±11.44*105.27±9.20#88.47±7.22#△63.78±5.70#△&

3 討論

膿毒癥急性肺損傷是多種因素導(dǎo)致的肺臟功能異常，使肺表面的活性物質(zhì)降低，出現(xiàn)水腫、肺膨脹不全等表現(xiàn)［7］。目前，關(guān)于急性肺損傷的診斷方法和治療方法相對(duì)較少，本研究通過采用LPS誘導(dǎo)建立膿毒癥急性肺損傷動(dòng)物模型，觀察膿毒癥急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制。已有研究報(bào)道，LPS誘導(dǎo)建立急性肺損傷模型后，能改變肺組織濕干比，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6等過度釋放，增加活性氧產(chǎn)生和降低抗氧化物酶活性，導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生損傷［8-9］。SOD、GSH-Px屬于抗氧化物酶，具清除機(jī)體內(nèi)氧自由基的能力，可以反映氧化應(yīng)激損傷程度［10］。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，其含量的高低能夠反映氧化損傷的程度［11］。本研究結(jié)果顯示，模型組內(nèi)大鼠肺組織濕干比增加，細(xì)胞凋亡率上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax、p53蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，SOD活性、GSH-Px活性降低，MDA含量明顯增加，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌明顯增加，這說明本研究用LPS誘導(dǎo)建立的膿毒癥急性肺損傷大鼠模型構(gòu)建成功。

柴胡化學(xué)成分較為復(fù)雜，有皂苷類、揮發(fā)油類、多糖類和黃酮類等，其中皂苷類化合物據(jù)今已被報(bào)道的有100多種［12］。皂苷A和D是最早從柴胡內(nèi)提出分離的，皂苷B2是齊墩果二烯型衍生物，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，柴胡皂苷具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、保肝、調(diào)節(jié)免疫等［13-14］。有研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷對(duì)大鼠肺組織具有保護(hù)用，能降低肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)目，抑制IL-6、TNF-α和iNOS含量，減輕大鼠肺組織炎性浸潤和纖維化程度［15］。高子涵等［16］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷B2能夠降低過氧化氫誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，降低Bax蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)，提高肝癌細(xì)胞的抗凋亡能力。呂行直等［17］研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷B2可以降低四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷血清內(nèi)MDA含量，增加SOD活性，提高機(jī)體的抗氧化能力。以上說明柴胡皂苷具有良好的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力，但是關(guān)于柴胡皂苷B2對(duì)急性肺損傷的研究尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，給予注射不同劑量的柴胡皂苷B2后，能降低LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織濕干比，減少細(xì)胞凋亡率，下調(diào)Bax、p53蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)SOD活性、GSH-Px活性，降低MDA含量，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌，說明柴胡皂苷B2能減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥急性肺損傷。

綜上所述，柴胡皂苷B2對(duì)膿毒癥急性肺損傷具有保護(hù)作用，能減輕其氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，但具體研究機(jī)制需要進(jìn)一步探究。