石斛降血脂作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

莊靜雯，方 敏，林靜怡，林陽榕，趙 楠，林 凡（通信作者），王 鶴

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福建 福州 350122）

隨著社會(huì)生活水平的提高，高脂血癥為代表的血脂異常人群不斷增多。據(jù)統(tǒng)計(jì)在城市老年居民人群（＞65歲）中血脂異常占比約35.11%，邊緣升高者達(dá)28.57%。血脂異?？蓪?dǎo)致心腦血管疾病、糖尿病等慢性病患病風(fēng)險(xiǎn)大增，嚴(yán)重影響居民健康，成為公共健康的主要問題之一。目前，臨床上治療高脂血癥的主要藥物是他汀類、貝特類等西藥。雖然這些藥物降脂效果顯著，但其不良反應(yīng)（如橫紋肌溶解、肝損傷、誘發(fā)腫瘤、導(dǎo)致糖尿病等）日益引發(fā)人們的關(guān)注。而中醫(yī)藥在該領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)越來越受人們認(rèn)可。石斛為我國傳統(tǒng)名貴中藥，1 500年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》即有記載，主傷中，除痹，下氣，具益胃生津、滋陰清熱、補(bǔ)五臟虛勞羸瘦之功效。一些研究表明，石斛具有調(diào)節(jié)脂類代謝，降低血脂的功效，但具體機(jī)制尚不明確，影響其臨床應(yīng)用與深入研發(fā)。隨著網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)分析的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可利用中藥成分、化合物靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)庫，從系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)相互作用的角度，整體性、系統(tǒng)性對(duì)中藥進(jìn)行理藥分析。這與中醫(yī)藥的“整體觀、辯證論治”的原則相符。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為研究中藥作用分子機(jī)制的常用新手段。為此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析石斛降低血脂的相關(guān)靶蛋白和信號(hào)通路，為后繼研究提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 主要數(shù)據(jù)庫

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http://ibtshk-bu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/up-loadlists/），OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/），STRING數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org）。

1.2 “石斛治療高脂血癥潛在靶點(diǎn)”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索收集高脂血癥（Hyperlipidemia）的相關(guān)基因，并經(jīng)uniprot矯正名稱。將前期研究已獲取的石斛活性成分所對(duì)應(yīng)的靶蛋白與高脂血癥的相關(guān)基因取交集，獲取石斛治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)。在STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI后，將結(jié)果采用Cytoscape 3.8.0的“NetworkAnalyzer”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩出核心靶點(diǎn)。分析時(shí)，以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的自由度值代表與該節(jié)點(diǎn)相連邊的條數(shù)，以中介中心性描述該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用和影響程度。上述參數(shù)越大，提示該節(jié)點(diǎn)所代表蛋白在石斛治療高脂血癥中的作用越大。

1.3 GO分析與KEGG通路富集分析

石斛治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換基因格式后，導(dǎo)入Omishare平臺(tái)進(jìn)行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析，＜0.05表明富集結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 “石斛治療高脂血癥潛在靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

前期研究發(fā)現(xiàn)石斛活性成分有391種，TCMSP數(shù)據(jù)庫分析表明活性成分（OB＞20%）有15個(gè)，活性成分潛在作用靶點(diǎn)有57個(gè)。Genecards查詢高血脂相關(guān)基因，獲得1 481個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，通過uniprot矯正名稱后，對(duì)應(yīng)1 376個(gè)靶點(diǎn)。對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，21個(gè)石斛活性成分靶蛋白為高脂血癥相關(guān)基因，提示石斛具有治療高脂血癥的作用。

“石斛治療高脂血癥潛在靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖1）分析結(jié)果得到自由度和中介中心性排序前10位的靶點(diǎn)分別為環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2, PTGS2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1, ESR1）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein, APP）、基質(zhì)金屬蛋白酯9（matrix metallopeptidase, MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酯2（MMP2）、糖原合成酶-3（glycogen synthase kinase-3 beta, GSK3B）、雌激素受體2（estrogen receptor 2, ESR2）、性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone binding globulin, SHBG）、細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶（cytochrome P450Scc, CYP11A1）、花生四烯5-脂氧合酶基因（arachidonate 5-lipoxygenase gene, ALOX5）。上述靶點(diǎn)的自由度與中介中心性的具體數(shù)值見表1。

圖1 “石斛治療高脂血癥潛在靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 石斛治療高脂血癥關(guān)鍵預(yù)測(cè)靶蛋白注釋

2.2 GO與KEGG分析結(jié)果

GO富集結(jié)果（＜0.05）顯示，重復(fù)節(jié)點(diǎn)主要富集于結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑等分子功能，以及對(duì)刺激的反應(yīng)、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。

KEGG分析結(jié)果（＜0.05）獲得30條信號(hào)通路，將前20條通路轉(zhuǎn)化為柱狀圖（見圖3），主要有雌激素信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、白介素17信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗等信號(hào)通路。

圖2 石斛治療高脂血癥潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3.討論

當(dāng)前，高脂血癥主要表現(xiàn)為總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的升高，是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。作為一種常見的代謝性疾病，高血脂癥已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。中醫(yī)藥對(duì)于高脂血癥的治療有著豐富的資源和臨床經(jīng)驗(yàn)。石斛是一種常用中草藥，可用來治療高脂血癥。因其可食，具有長(zhǎng)期使用安全的優(yōu)勢(shì)。然而，中藥的多組分、多靶點(diǎn)、整體性的特點(diǎn)使闡明石斛降血脂的作用機(jī)制具有挑戰(zhàn)性。

本研究借用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析石斛治療高脂血癥的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可能作用于21個(gè)高脂血癥相關(guān)基因。其中PTGS2、ESR1、APP、MMP9、MMP2、ESR2、ALOX5等石斛活性成分靶蛋白位于雌激素信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、內(nèi)分泌抵抗、白介素17（IL-17）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等關(guān)鍵信號(hào)通路。

雌激素信號(hào)途徑是人體代謝調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵信號(hào)，雌激素受體（ESR）高度參與雌激素介導(dǎo)的底物代謝調(diào)節(jié)，與脂類代謝密切相關(guān)。ESR1表達(dá)水平與脂肪量呈負(fù)相關(guān)，并受環(huán)境因素（包括熱量消耗、運(yùn)動(dòng)和溫度）的調(diào)控。ESR1作用的降低會(huì)損害線粒體功能，破壞機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致體重增加，體內(nèi)脂類積累，血脂明顯上升和炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象。臨床研究也表明，ESR1和ESR2基因多態(tài)性與成人的血脂水平相關(guān)。此外，位于雌激素信號(hào)途徑上的關(guān)鍵靶點(diǎn)MMP9和MMP2均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶分子家族，是一類鋅依賴性內(nèi)肽酶，被認(rèn)為是治療代謝性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其活性的抑制對(duì)高膽固醇血癥及其并發(fā)癥具有心臟保護(hù)作用。

流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和花生四烯酸代謝信號(hào)通路等參與促炎因子和炎癥因子的分泌、血管生成、血管張力調(diào)節(jié)、白細(xì)胞募集和細(xì)胞黏附等一系列高脂血癥相關(guān)血管病變的炎癥相關(guān)事件。其中，流體剪切應(yīng)力大小及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用頻率的變化，會(huì)通過相應(yīng)的機(jī)械感受器傳遞給血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起相關(guān)信號(hào)通路的改變。這是動(dòng)脈粥樣硬化的重要促因。而IL-17是一種促血管生成因子，其表達(dá)增加可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的血管生成，亦具有促動(dòng)脈粥樣硬化特性。本文結(jié)果提示石斛可能同時(shí)作用于上述信號(hào)通路的多個(gè)靶點(diǎn)，通過協(xié)同作用，在調(diào)節(jié)脂類代謝的同時(shí)預(yù)防和改善糖脂代謝紊亂繼發(fā)的并發(fā)癥。

綜上所述，石斛通過多靶點(diǎn)、多途徑，整體調(diào)節(jié)脂類代謝及其相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而治療高脂血癥。