石斛降血脂作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

莊靜雯，方 敏，林靜怡，林陽榕，趙 楠，林 凡（通信作者），王 鶴

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福建 福州 350122）

隨著社會生活水平的提高，高脂血癥為代表的血脂異常人群不斷增多。據(jù)統(tǒng)計在城市老年居民人群（＞65歲）中血脂異常占比約35.11%，邊緣升高者達28.57%。血脂異?？蓪?dǎo)致心腦血管疾病、糖尿病等慢性病患病風(fēng)險大增，嚴(yán)重影響居民健康，成為公共健康的主要問題之一。目前，臨床上治療高脂血癥的主要藥物是他汀類、貝特類等西藥。雖然這些藥物降脂效果顯著，但其不良反應(yīng)（如橫紋肌溶解、肝損傷、誘發(fā)腫瘤、導(dǎo)致糖尿病等）日益引發(fā)人們的關(guān)注。而中醫(yī)藥在該領(lǐng)域的優(yōu)勢越來越受人們認可。石斛為我國傳統(tǒng)名貴中藥，1 500年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》即有記載，主傷中，除痹，下氣，具益胃生津、滋陰清熱、補五臟虛勞羸瘦之功效。一些研究表明，石斛具有調(diào)節(jié)脂類代謝，降低血脂的功效，但具體機制尚不明確，影響其臨床應(yīng)用與深入研發(fā)。隨著網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)分析的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可利用中藥成分、化合物靶點等數(shù)據(jù)庫，從系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)相互作用的角度，整體性、系統(tǒng)性對中藥進行理藥分析。這與中醫(yī)藥的“整體觀、辯證論治”的原則相符。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為研究中藥作用分子機制的常用新手段。為此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析石斛降低血脂的相關(guān)靶蛋白和信號通路，為后繼研究提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 主要數(shù)據(jù)庫

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://ibtshk-bu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/up-loadlists/），OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/），STRING數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org）。

1.2 “石斛治療高脂血癥潛在靶點”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索收集高脂血癥（Hyperlipidemia）的相關(guān)基因，并經(jīng)uniprot矯正名稱。將前期研究已獲取的石斛活性成分所對應(yīng)的靶蛋白與高脂血癥的相關(guān)基因取交集，獲取石斛治療高脂血癥的潛在靶點。在STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI后，將結(jié)果采用Cytoscape 3.8.0的“NetworkAnalyzer”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，篩出核心靶點。分析時，以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的自由度值代表與該節(jié)點相連邊的條數(shù)，以中介中心性描述該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的作用和影響程度。上述參數(shù)越大，提示該節(jié)點所代表蛋白在石斛治療高脂血癥中的作用越大。

1.3 GO分析與KEGG通路富集分析

石斛治療高脂血癥的潛在靶點轉(zhuǎn)換基因格式后，導(dǎo)入Omishare平臺進行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析，＜0.05表明富集結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 “石斛治療高脂血癥潛在靶點”PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

前期研究發(fā)現(xiàn)石斛活性成分有391種，TCMSP數(shù)據(jù)庫分析表明活性成分（OB＞20%）有15個，活性成分潛在作用靶點有57個。Genecards查詢高血脂相關(guān)基因，獲得1 481個相關(guān)靶點，通過uniprot矯正名稱后，對應(yīng)1 376個靶點。對比分析發(fā)現(xiàn)，21個石斛活性成分靶蛋白為高脂血癥相關(guān)基因，提示石斛具有治療高脂血癥的作用。

“石斛治療高脂血癥潛在靶點”PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖1）分析結(jié)果得到自由度和中介中心性排序前10位的靶點分別為環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2, PTGS2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1, ESR1）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein, APP）、基質(zhì)金屬蛋白酯9（matrix metallopeptidase, MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酯2（MMP2）、糖原合成酶-3（glycogen synthase kinase-3 beta, GSK3B）、雌激素受體2（estrogen receptor 2, ESR2）、性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone binding globulin, SHBG）、細胞色素P450側(cè)鏈裂解酶（cytochrome P450Scc, CYP11A1）、花生四烯5-脂氧合酶基因（arachidonate 5-lipoxygenase gene, ALOX5）。上述靶點的自由度與中介中心性的具體數(shù)值見表1。

圖1 “石斛治療高脂血癥潛在靶點”PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 石斛治療高脂血癥關(guān)鍵預(yù)測靶蛋白注釋

2.2 GO與KEGG分析結(jié)果

GO富集結(jié)果（＜0.05）顯示，重復(fù)節(jié)點主要富集于結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑等分子功能，以及對刺激的反應(yīng)、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。

KEGG分析結(jié)果（＜0.05）獲得30條信號通路，將前20條通路轉(zhuǎn)化為柱狀圖（見圖3），主要有雌激素信號通路、花生四烯酸代謝、白介素17信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、內(nèi)分泌抵抗等信號通路。

圖2 石斛治療高脂血癥潛在靶點的KEGG通路富集分析

3.討論

當(dāng)前，高脂血癥主要表現(xiàn)為總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的升高，是心血管疾病的危險因素之一。作為一種常見的代謝性疾病，高血脂癥已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。中醫(yī)藥對于高脂血癥的治療有著豐富的資源和臨床經(jīng)驗。石斛是一種常用中草藥，可用來治療高脂血癥。因其可食，具有長期使用安全的優(yōu)勢。然而，中藥的多組分、多靶點、整體性的特點使闡明石斛降血脂的作用機制具有挑戰(zhàn)性。

本研究借用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析石斛治療高脂血癥的作用機制，發(fā)現(xiàn)其可能作用于21個高脂血癥相關(guān)基因。其中PTGS2、ESR1、APP、MMP9、MMP2、ESR2、ALOX5等石斛活性成分靶蛋白位于雌激素信號通路、花生四烯酸代謝、內(nèi)分泌抵抗、白介素17（IL-17）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等關(guān)鍵信號通路。

雌激素信號途徑是人體代謝調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵信號，雌激素受體（ESR）高度參與雌激素介導(dǎo)的底物代謝調(diào)節(jié)，與脂類代謝密切相關(guān)。ESR1表達水平與脂肪量呈負相關(guān)，并受環(huán)境因素（包括熱量消耗、運動和溫度）的調(diào)控。ESR1作用的降低會損害線粒體功能，破壞機體代謝穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致體重增加，體內(nèi)脂類積累，血脂明顯上升和炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象。臨床研究也表明，ESR1和ESR2基因多態(tài)性與成人的血脂水平相關(guān)。此外，位于雌激素信號途徑上的關(guān)鍵靶點MMP9和MMP2均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶分子家族，是一類鋅依賴性內(nèi)肽酶，被認為是治療代謝性疾病的關(guān)鍵靶點。其活性的抑制對高膽固醇血癥及其并發(fā)癥具有心臟保護作用。

流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路和花生四烯酸代謝信號通路等參與促炎因子和炎癥因子的分泌、血管生成、血管張力調(diào)節(jié)、白細胞募集和細胞黏附等一系列高脂血癥相關(guān)血管病變的炎癥相關(guān)事件。其中，流體剪切應(yīng)力大小及其對血管內(nèi)皮細胞作用頻率的變化，會通過相應(yīng)的機械感受器傳遞給血管內(nèi)皮細胞，引起相關(guān)信號通路的改變。這是動脈粥樣硬化的重要促因。而IL-17是一種促血管生成因子，其表達增加可能促進動脈粥樣硬化斑塊中的血管生成，亦具有促動脈粥樣硬化特性。本文結(jié)果提示石斛可能同時作用于上述信號通路的多個靶點，通過協(xié)同作用，在調(diào)節(jié)脂類代謝的同時預(yù)防和改善糖脂代謝紊亂繼發(fā)的并發(fā)癥。

綜上所述，石斛通過多靶點、多途徑，整體調(diào)節(jié)脂類代謝及其相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而治療高脂血癥。