PET/CT 在小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊篩查中的價(jià)值

丁恩慈 郭建華 沈婕

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種逐漸進(jìn)展的動脈炎性疾病。隨著世界人口老齡化及風(fēng)險(xiǎn)因素暴露時(shí)間延長，AS 易損斑塊的破裂和繼發(fā)血栓導(dǎo)致卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。分子成像可以在疾病臨床癥狀出現(xiàn)之前便提供相關(guān)的病理生理學(xué)信息，使得準(zhǔn)確測定斑塊的組成成分并識別易損和高風(fēng)險(xiǎn)斑塊成為可能[2]。PET/CT 可同時(shí)了解斑塊的狹窄程度及斑塊的代謝情況，能夠無創(chuàng)性評價(jià)斑塊性質(zhì)，利用其顯像劑在人體內(nèi)AS 斑塊區(qū)特異性或非特異性聚集，使得冠狀動脈許多早期隱匿性病變（如炎性病變、早期微鈣化灶等）得到顯示[3-4]。

目前，氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG）、氟化鈉（18FNaF）、68Ga-奧曲肽（68Ga-DOTATATE，簡寫為68Ga-DOTA）等已經(jīng)用于AS 斑塊的研究。18F-FDG 廣泛用于活體炎癥細(xì)胞的識別，18F-NaF 在體內(nèi)AS 斑塊的鈣化中特異性聚集[5]，68Ga-DOTA PET/CT 對非鈣化斑塊和點(diǎn)狀斑塊等高風(fēng)險(xiǎn)冠狀動脈病變有良好的診斷準(zhǔn)確性[6]。但國內(nèi)外尚無將這3 種顯像劑同時(shí)用于動物的研究。本研究擬采用3 種顯像劑的PET/CT 對不同月齡ApoE 基因敲除小鼠的AS 易損斑塊顯像，探討3 種顯像劑檢測易損斑塊的可行性及臨床應(yīng)用價(jià)值，并篩選出對易損斑塊最有價(jià)值的顯像劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 高脂組為雄性ApoE 基因敲除小鼠18 只，8 周齡，體質(zhì)量（19±2）g，全程喂養(yǎng)高脂飼料（膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、豬膽鹽0.35%、基礎(chǔ)飼料78.65%）。喂養(yǎng)17 周、23 周時(shí)各死亡1 只，及時(shí)補(bǔ)充同類型同月齡小鼠。對照組為雄性C57BL/6 普通小鼠18 只，8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，全程喂養(yǎng)普通飼料。所有小鼠及飼料均購自天津放射醫(yī)學(xué)研究所動物中心[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（津）2019-0002]。記錄飼養(yǎng)前后全部小鼠的體質(zhì)量、血脂（游離脂肪酸、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇）水平。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 小鼠分組 高脂組和對照組均采用隨機(jī)數(shù)字表法分別均分為2 組，即高脂1 組、高脂2 組、對照1 組、對照2 組，每組9 只。高脂1 組及對照1 組于喂養(yǎng)18 周時(shí)行PET/CT 檢查，高脂2 組及對照2 組于27 周時(shí)行PET/CT 檢查。4 組小鼠各自隨機(jī)分成3 個(gè)小組，每組3 只，分別給予3 種顯像劑（18F-FDG、18F-NaF、68Ga-DOTA）進(jìn)行檢查。

1.3 PET/CT 成像 采用美國GE 公司的Explorer Vista micro-PET/CT 設(shè)備及圖像后處理系統(tǒng)。顯像劑（18F-FDG、18F-NaF、68Ga-DOTA）由解放軍總醫(yī)院（301 醫(yī)院）PET-CT 中心提供，放化純度≥95%。所有小鼠禁食6 h 后經(jīng)尾靜脈注射18F-FDG（或18F-NaF、68Ga-DOTA）(劑量均為1.0 mCi/kg)，60 min 后吸入異氟烷麻醉，將小鼠仰臥位固定于塑料板上以盡可能減少移動，隨后進(jìn)行PET/CT 掃描。CT 掃描參數(shù)：管電壓50 kV，管電流200 μA，曝光時(shí)間200 ms，掃描范圍自小鼠頭部至尾部；PET 進(jìn)行三維采集，采集時(shí)間共15 min，PET 影像采用CT 衰減校正和濾過反投影算法進(jìn)行影像重建。顯像結(jié)束后處死小鼠，從升主動脈向下剖離至腹主動脈髂血管分叉處，進(jìn)行離體腹主動脈PET/CT 成像。

1.4 影像分析 由2 位核醫(yī)學(xué)科5 年以上經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師分別對各組小鼠的PET/CT 影像進(jìn)行測量和分析，最后取2 位醫(yī)師測量值的平均值，意見不一致時(shí)商討確定。觀察及測量內(nèi)容：①記錄腹主動脈長度，在PET 及CT 上綜合確定AS 斑塊區(qū)，記錄斑塊數(shù)量并測量每只小鼠腹主動脈的最大斑塊長度。在CT 上測量斑塊的平均CT 值，注意避開周圍脂肪組織。②在PET 上測量斑塊的標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（standard uptake value，SUV）并記錄最大值（SUVmax）及平均值（SUVmean）。分別計(jì)算不同顯像劑的最大和平均斑塊靶本比值（target-to-background ratio，TBR），即TBR-SUVmax及TBR-SUVmean；計(jì)算公式為TBR=SUV斑塊/SUV本底，其中SUV 本底為腹主動脈無攝取區(qū)域的SUV 值，SUV斑塊以SUVmax高于本底20%的病灶作為陽性斑塊，測量其SUV 值。

1.5 病理分析 根據(jù)Naghavi 等[7]歸納的病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，有以下病理學(xué)特征之一即可視為AS 易損斑塊：①斑塊脂質(zhì)核心增大伴纖維帽變薄、巨噬細(xì)胞浸潤、有破裂傾向；②亞阻塞血栓形成伴早期機(jī)化的破裂斑塊；③含蛋白糖基質(zhì)平滑肌細(xì)胞豐富的侵蝕傾向斑塊；④亞阻塞血栓形成的侵蝕斑塊；⑤斑塊內(nèi)出血；⑥浸潤血管壁的鈣化結(jié)節(jié)；⑦慢性狹窄性斑塊伴嚴(yán)重鈣化、陳舊性血栓形成及管腔向心性狹窄。對4 組小鼠的離體腹主動脈進(jìn)行病理分析，記錄每只小鼠腹主動脈易損斑塊數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)評估計(jì)量資料分布的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；3組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠離體血管的病理結(jié)果 高脂1 組、高脂2 組的腹主動脈分別有易損斑塊35、38 處，對照1 組、對照2 組分別有易損斑塊6、8 個(gè)。高脂組病理主要表現(xiàn)為動脈內(nèi)壁表面多量膠原纖維構(gòu)成的纖維帽，其內(nèi)多發(fā)泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶，局部炎癥細(xì)胞浸潤；免疫組化顯示泡沫細(xì)胞陽性（圖1）。對照組則血管較平滑，斑塊偶發(fā)。

圖1 高脂組小鼠腹主動脈病理及免疫組化圖。A 圖為HE 染色（×200）。B 圖為天狼猩紅染色（×200），示腹主動脈不同纖維被染成不同顏色。C 圖為免疫組化圖。

2.2 高脂組與對照組小鼠離體血管基本情況比較 高脂1 組及對照1 組在PET/CT 上分別發(fā)現(xiàn)32、5 處斑塊，高脂2 組及對照2 組分別發(fā)現(xiàn)34、6處斑塊。高脂組及對照組間血管長度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高脂組的最大斑塊長度均高于對照組（P＜0.05）。高脂2 組血管斑塊的平均CT 值高于對照2 組（P＜0.05），高脂1 組與對照1 組的斑塊平均CT 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 高脂組（1 組、2 組）和對照組（1 組、2 組）小鼠離體血管的基本情況比較

2.3 不同顯像劑在不同月齡高脂組間的顯像結(jié)果比較18F-FDG 和18F-NaF 顯像后，斑塊區(qū)血管壁的CT 密度不均勻，PET 和PET/CT 影像上均可見多發(fā)異常放射性濃集（圖2、3）。68Ga-DOTA 顯像后，斑塊區(qū)血管壁CT 密度不均勻，但PET 和PET/CT 影像上未見異常放射性濃集。

2.3.118F-FDG PET/CT 高脂1 組及2 組分別發(fā)現(xiàn)12、13 處斑塊。高脂2 組的本底SUVmax及SUVmean均高于高脂1 組（P＜0.05），而高脂1 組的TBR-SUVmax和TBR-SUVmean均高于高脂2 組（P＜0.05）。2 組間18F-FDG 的SUVmax、SUVmean差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。PET/CT 顯像如圖2 所示。

表2 2 個(gè)高脂組間斑塊18F-FDG PET/CT 代謝參數(shù)比較

圖2 高脂組小鼠離體腹主動脈斑塊18F-FDG PET/CT 影像。由上到下每行分別為CT、PET 和PET/CT 融合圖影像，從左到右分別為血管的橫斷面、矢狀面、冠狀面影像。

2.3.218F-NaF PET/CT 高脂1 組及2 組分別發(fā)現(xiàn)11、12 處斑塊。2 組間代謝參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表3。

表3 2 個(gè)高脂組間斑塊18F-NaF PET/CT 代謝參數(shù)比較

2.3.368Ga-DOTA PET/CT 高脂1 組及2 組的68Ga-DOTA PET/CT 上分別發(fā)現(xiàn)9 處斑塊。高脂1 組的本底SUVmax及SUVmean均高于高脂2 組（P＜0.05），其他代謝參數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。詳見表4。

表4 2 個(gè)高脂組間斑塊18Ga-DOTA PET/CT 代謝參數(shù)比較

2.4 高脂組小鼠3 種顯像劑間PET/CT 代謝參數(shù)比較 高脂1 組和高脂2 組中，18F-FDG 、18F-NaF 和68Ga-DOTA PET/CT 的SUVmax（F1組=214.424，F(xiàn)2組=165.846）、SUVmean（F1組=107.590，F(xiàn)2組=80.581）、本底SUVmax（F1組=48.356，F(xiàn)2組=53.926）及本底SUVmean（F1組=48.356，F(xiàn)2組=34.442）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），其中18F-NaF 的上述參數(shù)均高于18FFDG 顯像，18F-FDG 及18F-NaF 均高于68Ga-DOTA（均P＜0.05）；而3 種顯像劑間TBR-SUVmax（F1組=50.798，P=0.239；F2組=52.921，P=0.478）、TBR-SUVmean（F1組=55.418，P=0.130；F2組=57.897，P=0.275）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

易損斑塊的早期識別是疾病預(yù)防的基礎(chǔ)，已成為心血管病診斷及預(yù)防的重要手段[8]。近年來核素分子顯像已經(jīng)用于易損斑塊識別及療效的監(jiān)測，多模態(tài)分子影像平臺（如PET/CT、PET/MR、MR/CT）診斷動脈易損斑塊不僅可以顯示斑塊的位置、大小及形態(tài)，還可以檢測斑塊的組成成分，評估斑塊的穩(wěn)定性和易損程度[9-10]。本研究將18F-FDG、18F-NaF 及68Ga-DOTA 這3 種顯像劑用于不同月齡的AS 模型小鼠和對照組，分析其檢測AS 易損斑塊的可行性及臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖3 高脂組小鼠離體腹主動脈斑塊18F-NaF PET/CT 影像。由上到下每行分別為CT、PET 和PET/CT 融合圖影像，從左到右分別為血管的橫斷面、矢狀面、冠狀面影像。

3.1 PET/CT 在AS 小鼠模型易損斑塊中的應(yīng)用 本研究主要對高脂組及對照組小鼠離體腹主動脈進(jìn)行了3 種顯像劑的PET/CT 顯像，同月齡小鼠高脂組的病變數(shù)量、長度均較對照組明顯增加，CT 值也更高，而高月齡組（高脂2 組）小鼠離體血管的斑塊病灶數(shù)量及最大病變長度均較低月齡組（高脂1 組）增加，說明ApoE 基因敲除小鼠配合高脂飼養(yǎng)可以成功獲得AS 小鼠模型。這類動物模型與人類血管的內(nèi)膜鈣化情況相似，動脈硬化早期會產(chǎn)生微鈣化，易損斑塊中可檢測到微鈣化和大鈣化[11]，18F-NaF 在活動性微鈣化中聚集的特點(diǎn)使18F-NaF PET/CT 顯像成為可能。王等[12]研究發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠主動脈對18F-FDG 的攝取值明顯高于對照組C57BL/6N 小鼠，并在血管離體顯像中發(fā)現(xiàn)顯像斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于未顯像的斑塊，說明18F-FDG 的攝取能反映斑塊的炎癥程度，進(jìn)一步識別易損斑塊。生長抑素受體結(jié)合物68Ga-DOTA，可以特異性結(jié)合在人類巨噬細(xì)胞處特異性表達(dá)的生長抑素受體2。國外有研究[13]報(bào)道ApoE 基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)68Ga-DOTA 在巨噬細(xì)胞聚集處攝取明顯增高。

3.218F-FDG 用于AS 斑塊的價(jià)值18F-FDG 是目前比較實(shí)用的用于動脈硬化斑塊PET 顯像研究的顯像劑，已經(jīng)成功用于主動脈和頸動脈的斑塊顯像。18F-FDG 在炎癥區(qū)積聚的特點(diǎn)已經(jīng)被用來量化AS 中積累的炎癥細(xì)胞[14]。其中，易損斑塊中的巨噬細(xì)胞是促使冠心病向不良心血管事件不斷進(jìn)展的因素，其數(shù)量與SUV 值高度相關(guān)[15]；SUVmax可間接反映AS 易損斑塊的炎癥程度和穩(wěn)定性。趙等[16]采用18F-FDG PET/CTA 成像檢測兔主動脈易損斑塊，發(fā)現(xiàn)在斑塊破裂誘發(fā)實(shí)驗(yàn)之前，易損斑塊FDG 攝取值明顯高于穩(wěn)定斑塊；誘發(fā)實(shí)驗(yàn)后，有血栓形成的動脈段的FDG 攝取值明顯高于無血栓形成的動脈段。本研究對小鼠進(jìn)行18F-FDG 顯像發(fā)現(xiàn)，高脂組腹主動脈斑塊區(qū)存在放射性異常濃集，相應(yīng)部位血管壁的CT 密度不均勻，故證實(shí)18F-FDG PET/CT 對于斑塊識別具有較高的特異性。但18F-FDG 用于冠狀動脈活體易損斑塊的特異性并不強(qiáng)，主要因?yàn)樾募〖?xì)胞對其的大量攝取在一定程度上會抑制較細(xì)血管對其攝取。通過禁食、降低血糖等方法可以有效降低心肌細(xì)胞對18F-FDG 的攝取，未來有望用于臨床。

3.318F-NaF 用于鑒別AS 斑塊有重要的價(jià)值 AS斑塊的鈣化是一種與新骨形成極為相似的受調(diào)控的主動性代謝過程，其鈣鹽的主要成分是羥磷灰鈣，18F-NaF 通過替換羥基參于羥磷灰鈣的代謝，在血管早期鈣化及微鈣化中濃集[17]。使用18F-NaF micro-PET/CT 即可在臨床前研究中檢測微鈣化，具有較高的敏感性和特異性[18]。陳等[19]通過兔AS 模型活體顯像研究提出，18F-NaF 較18F-FDG 能夠更準(zhǔn)確地用于檢測微鈣化及易損斑塊。本研究發(fā)現(xiàn)18FNaF 顯像的SUVmax值要高于18F-FDG，更容易識別斑塊，但18F-NaF 顯像對小鼠18 周及27 周時(shí)的代謝參數(shù)的差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其在早期及中晚期斑塊的辨認(rèn)上可能有同等價(jià)值。McKenney Drake等[3]發(fā)現(xiàn)，相比18F-FDG，18F-NaF 放射性活性與疾病的臨床和病理有更高的相關(guān)性。18F-NaF 攝取標(biāo)志著中早期不穩(wěn)定斑塊中微鈣化灶的存在，其攝取率與心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[20]。因此，18F-NaF 用于AS 病人可以提前鑒別易損斑塊，有利于有效且針對性地治療。

3.468Ga 標(biāo)記的示蹤劑用于AS 斑塊的價(jià)值68Ga標(biāo)記的示蹤劑可用于AS 斑塊成像，如68Gapentixafor 已用于冠狀動脈等小血管成像[21-22]。68Ga-DOTA 在近年來也受到廣泛關(guān)注，其對生長抑素受體2 有高度的親和性和選擇性，在巨噬細(xì)胞聚集處攝取明顯增高，且具有TBR 較高、不易被心肌細(xì)胞攝取等特點(diǎn)，有可能成為未來評估不穩(wěn)定斑塊炎癥活性良好的示蹤劑，較18F-FDG 更適用于冠狀動脈成像[6]。但本研究中發(fā)現(xiàn)68Ga-DOTA 對AS 斑塊的檢出極低，在不同月齡高脂小鼠中幾乎無放射性濃集，可能是因?yàn)楸狙芯恐懈咧M小鼠已經(jīng)是AS 中期及后期，巨噬細(xì)胞聚集不夠多，也可能是因?yàn)橐讚p斑塊本身不攝取68Ga-DOTA，因此不建議68Ga-DOTA 用于AS，至于其他68Ga 標(biāo)記的顯像劑有待進(jìn)一步研究。

3.5 高脂小鼠中3 種顯像劑的PET/CT 影像分析 高脂組小鼠18F-FDG 和18F-NaF 顯像中斑塊表現(xiàn)出放射性異常濃集，68Ga-DOTA 組則無明顯放射性濃集，體現(xiàn)了前2 種顯像劑檢測AS 斑塊的可行性及臨床價(jià)值。同月齡小鼠離體血管18F-NaF 的斑塊SUVmax與SUVmean、本底SUVmax與SUVmean均高于18FFDG 組，說明18F-NaF 較18F-FDG 識別易損斑塊更加敏感；此外，18F-NaF 的心肌攝取較低，因而較18FFDG 更適用于冠狀動脈顯像。另外，本研究還比較了TBR 值，TBR 綜合考慮了斑塊及本底的攝取，可以去除本底的影響因素，是比較推薦使用的代謝參數(shù)。本研究中18F-NaF 和18F-FDG 的TBR 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較小有關(guān)，未來加大樣本量研究也許能獲得更可靠的結(jié)果。

3.6 局限性及展望 本研究局限性主要是小鼠實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，實(shí)驗(yàn)組活體顯像陽性的小鼠數(shù)目偏少，對照組小鼠顯像陽性部位更少，因此沒有進(jìn)行活體顯像分析；由于樣本量小，故未對3 種顯像劑在離體血管中的診斷效能進(jìn)行分析，未來將加大樣本量進(jìn)一步進(jìn)行診斷效能的研究，并進(jìn)一步將18FNaF 及18F-FDG 用于活體易損斑塊的研究，為AS易損斑塊的早期甄別提供更加可靠的無創(chuàng)性檢查手段。