干巴菌菌塘周圍云南松幼苗菌根真菌的物種多樣性及外部形態(tài)*

徐鋇昌，甘云浩，羅云生，鐘 華，趙 苗，靳博文，段麗華**

（1.昆明市林業(yè)和草原科學(xué)研究所，云南 昆明 650223；2.宜良縣國(guó)有花園林場(chǎng)，云南 昆明 652100）

干巴菌（Thelephora ganbajun M.Zang）隸屬擔(dān)子菌門（Basidomycotina）革菌科（Thelephoraceae）革菌屬（Thelephora），多生長(zhǎng)于滇中海拔800 m～2 200 m的松林中[1]。干巴菌富含多種氨基酸和鉀、鈣、鎂、鐵、銅、硒等人體必需元素，其中硒含量3.44 mg·100g-1，為云南常見(jiàn)18種野生食用菌中最高；并具獨(dú)特香味，深受滇中地區(qū)消費(fèi)者青睞；品質(zhì)好的干巴菌價(jià)格高達(dá)1 000元/kg以上[2]。干巴菌是一種與云南松、思茅松、滇油杉等林木有共生關(guān)系的外生菌根真菌；而云南松作為我國(guó)西南（特別是云南境內(nèi)）主要的建群樹種，其林下外生菌根真菌資源十分豐富；但菌根復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)方式使干巴菌不能脫離共生植物生存，且在其菌種分離過(guò)程中雜菌和其他雜質(zhì)污染嚴(yán)重，難以獲得純菌種；這成為干巴菌尚不能實(shí)現(xiàn)人工栽培的主要原因[3-5]。

現(xiàn)今，干巴菌的過(guò)度采摘已嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，為有效保護(hù)現(xiàn)有資源，許多研究者通過(guò)“包山養(yǎng)菌”來(lái)保護(hù)干巴菌賴以生存的森林環(huán)境，并開展干巴菌原生態(tài)微干預(yù)促繁措施，探索、提高野生干巴菌的產(chǎn)量及質(zhì)量[6]。也有研究人員對(duì)干巴菌進(jìn)行了一些遺傳多樣性分析、菌根形態(tài)特征等相關(guān)基礎(chǔ)研究[1，7]。為進(jìn)一步深入了解干巴菌生活史，王冉等[8]對(duì)兩個(gè)地區(qū)的8朵干巴菌子實(shí)體內(nèi)可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行分離，獲得282個(gè)菌株，以探討微生物與菌根真菌之間的相互作用關(guān)系。張珊珊等[9]探究了云南松林下干巴菌生長(zhǎng)的土壤理化性質(zhì)和有效態(tài)微量元素特征，分析了干巴菌適宜栽培的土壤環(huán)境。但要實(shí)現(xiàn)干巴菌人工栽培，尚需科研人員開展大量的實(shí)踐和研究。

由于外生菌根菌需要與特定的宿主植物共生，目前已有研究將塊菌[10]、暗褐網(wǎng)柄牛肝菌[11]接種到無(wú)菌苗的根部，合成外生菌根苗，進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育后移栽到野外，從而獲得子實(shí)體。但如何獲取干巴菌菌根苗、實(shí)現(xiàn)人工栽培的研究還較少，張光飛等[12]探索了不同栽培基質(zhì)下干巴菌侵染云南松幼苗形成菌根的條件，為干巴菌人工栽培提供了前期基礎(chǔ)。干巴菌菌根苗的培育是實(shí)現(xiàn)干巴菌人工栽培的重要途徑，因此，探索在自然狀態(tài)下干巴菌菌絲侵染云南松幼苗形成菌根苗的試驗(yàn)技術(shù)，對(duì)下一步實(shí)現(xiàn)干巴菌人工栽培具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地塊設(shè)在云南省昆明市宜良縣狗街鎮(zhèn)小哨社區(qū)居委會(huì)大狗黑地村，海拔1 760 m，年平均氣溫16.3℃。試驗(yàn)區(qū)以云南松為優(yōu)勢(shì)樹種，林下夾雜杜鵑和野胡椒，郁閉度約為0.4。土壤為森林紅壤，土層深厚肥沃，自然肥力較強(qiáng)。

1.2 云南松播種

1.2.1 種子收集及容器苗培育

云南松種子于2018年12月在宜良縣祿豐村林場(chǎng)云南松采種基地采集。

容器苗培育：2019年2月，用水浸泡云南松種子15 min，除去漂浮的空殼種子、蟲蛀及異粒種子；用50%多菌靈可濕性粉劑800倍液浸種消毒1 h，消毒后用清水清洗，將沖洗后的種子放入40℃左右溫水中浸泡24 h；自然冷卻涼干后播種于填滿營(yíng)養(yǎng)土的育苗器（規(guī)格為70 mm×70 mm）中，每穴播種2粒；種子出苗后進(jìn)行間苗，保留長(zhǎng)勢(shì)好的幼苗。云南松幼苗培育期為3個(gè)月～5個(gè)月。

1.2.2 種植方式

2019年6月，在云南松林內(nèi)選擇干巴菌菌塘80個(gè)，分2種方式進(jìn)行云南松種植。

1）種子穴播：60個(gè)菌塘，以菌塘為中心按“米”字形，以10 cm、20 cm、30 cm的間距每穴播種2?！?粒云南松種子，共計(jì)1 440穴。

2）容器苗種植：20個(gè)菌塘，以菌塘為中心按“米”字形，以10 cm、20 cm、30 cm的間距種植培育的云南松容器苗，在育苗器面對(duì)菌塘方向打16個(gè)小圓孔便于菌絲侵入，共計(jì)480株。

1.3 菌根采集及處理

1.3.1 菌根的采集

分別于3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行菌根采集：2019年9月、2020年6月～10月、2021年5月～9月。

采集時(shí)以干巴菌菌塘為中心，采用隨機(jī)取樣方式，種子穴播苗以云南松幼苗為半徑，用小鐵楸取云南松幼苗的根系，尋找側(cè)根；容器苗直接用小鐵楸將容器取出后尋找側(cè)根。觀察是否有菌根形成；找到菌根用鑷子等工具輕剝土壤后用枝剪剪取帶有菌根的側(cè)根，再將云南松幼苗種回原位；采集菌根時(shí)重點(diǎn)觀察菌根及菌絲的形成和分布情況。

1.3.2 樣品處理

菌根采集后進(jìn)行編號(hào)、拍照，帶回實(shí)驗(yàn)室置于4℃冰箱中保鮮待測(cè)。采集的樣品置于篩子中流水沖洗根部泥土，剪成1 cm根段，于體視顯微鏡下用鑷子、毛刷等進(jìn)一步清洗。

1.3.3 菌根的形態(tài)觀察

在體視顯微鏡下，觀察并記錄菌根的形狀、顏色、分叉等情況。

1.3.4 菌根的分子鑒定

分子鑒定采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)。使用的ITS引物為：

（1）ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′。

（2）ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

委托中科院昆明植物研究所提取菌根rDNA，使用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，將rDNA測(cè)序后得到的目標(biāo)序列在NCBI和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析，得到分子鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌塘觀察結(jié)果

干巴菌菌塘具體的觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 干巴菌菌塘Fig.1 The shiro of Thelephora ganbajun

如圖1A所示，以種子穴播的菌塘中，云南松幼苗0～20 cm周圍有干巴菌子實(shí)體，可觀察到干巴菌子實(shí)體經(jīng)發(fā)育后將云南松幼苗主桿包圍的現(xiàn)象。

如圖1B所示，以容器育苗的菌塘中，僅有1個(gè)種植點(diǎn)有干巴菌子實(shí)體出現(xiàn)在容器中。采用容器育苗主要便于菌根的觀察、采集以及今后移栽；由于未檢測(cè)到干巴菌菌根，無(wú)法對(duì)種子穴播和容器育苗2種種植方式進(jìn)行比較，但在采集完菌根后重新種植時(shí)發(fā)現(xiàn)，容器苗重新種植的成活率明顯高于種子穴播苗的成活率。

如圖1C所示，在原松林中云南松的菌塘中，據(jù)干巴菌子實(shí)體水平位置15 cm～20 cm、土壤深度2 cm～10 cm，均有許多肉眼可見(jiàn)的黑褐色老化菌根和黃白色新生菌根，新生菌根與老化菌根通常兩者交織、成片聚集。對(duì)觀察全部結(jié)果進(jìn)行總結(jié)發(fā)現(xiàn)，部分菌塘中采集干巴菌子實(shí)體時(shí)，其基部緊緊依附在已木栓化或干枯甚至死亡的云南松側(cè)根上，側(cè)根上有二叉分支結(jié)構(gòu)的黑褐色老化菌根和黃白色菌根，黑褐色老化菌根易碎，部分子實(shí)體基部未見(jiàn)有菌根或菌根長(zhǎng)在子實(shí)體中。

2.2 不同類型種類菌根外部形態(tài)特征和分子鑒定

2019年～2021年共采集到菌根樣品183個(gè)，經(jīng)體視顯微鏡初步篩選后對(duì)其中48株菌根大型真菌進(jìn)行rDNA ITS測(cè)序及比對(duì)，結(jié)果顯示確定到種水平的有10種，分別為血紅菇（Russula sanguinea），鮮艷乳菇（Lactarius vividus），刺孢擬小墊革菌（Tomentellopsis echinospora）， Russula brevipileocystidiata，西伯利亞乳牛肝菌（Suillus sibiricus），軸腹菌（Hydnangium carneum），黃褐乳菇（Lactarius cinnamomeus），小豹斑鵝膏（Amanita parvipantherina），變黑根須腹菌（Rhizopogon nigrescens），辛德鎖瑚菌（Clavulina thinadii）；確定到屬水平的有3種，分別屬于紅菇屬（Russula），長(zhǎng)毛盤菌屬（Trichophaea），棉革菌屬（Tomentella）；確定到科水平的有3種，分別屬于阿太菌科（Atheliaceae），火絲菌科（Pyronemataceae），革菌科（Thelephoraceae）。其中以紅菇屬最多，未檢測(cè)出干巴菌菌根。

對(duì)采集到的菌根樣品進(jìn)行體視顯微鏡宏觀形態(tài)觀察，其中16種不同的大型真菌共生外生菌根形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

如圖2所示，16種不同的大型真菌共生菌根的外部形態(tài)特征分別如下。

圖2 16種大型真菌共生的云南松幼苗外生菌根外部形態(tài)Fig.2 Ectomycorrhizal morphology of Pinus yunnanensis seedlings symbiotic with 16 macrofungi

1）血紅菇：菌根為黃棕色，單軸分支，外延菌絲少量。

2）紅菇屬菌株：菌根為亮黃色，單軸分支，外延菌絲少量。

3）阿太菌科菌株：菌根為亮黃色，不分支或二叉狀，表面吸附有少量土壤顆粒，外延菌絲少量。

4）鮮艷乳菇：菌根為黃白色，二叉狀多次分支，有少量外延菌絲

5）刺孢擬小墊革菌：菌根為黃棕色，二叉分支，菌根表面光滑。

6）小豹斑鵝膏：菌根為黃白色或淺黃綠色，棒狀或二叉分支，外延菌絲較少。

7）變黑根須腹菌：菌根為棕黃色，簇狀，菌根表面有棉絮狀米白色菌絲包裹。

8）Russula brevipileocystidiata：菌根為黃白色，棒狀不分支或單軸分支，有少量外延菌絲。

9）長(zhǎng)毛盤菌屬菌株：菌根為黑褐色，二叉分支，表面灰白色外延菌絲少量。

10）西伯利亞乳牛肝菌：菌根為褐色，單軸分支，表面有大量灰白色外延菌絲并吸附有土壤顆粒。

11）軸腹菌：菌根為黑褐色，不規(guī)則分支。

12）棉革菌屬菌株：菌根為黑褐色，二叉分支，表面有大量灰白色外延菌絲。

13）火絲菌科菌株：菌根為黑褐色，不分支或二叉分支，外延菌絲少量。

14）黃褐乳菇：菌根為亮黃色或黃白色，二叉分支，有少量外延菌絲并吸附有土壤顆粒。

15）革菌科菌株：菌根為褐色，不規(guī)則分支或塔狀分支，有大量灰白色外延菌絲。

16）辛德鎖瑚菌：菌根為黃褐色，不規(guī)則單軸塔狀，表面有較多灰白色外延菌絲。

3 討論與結(jié)論

干巴菌與云南松有著密切的共生關(guān)系，因此選擇在干巴菌菌塘播種云南松幼苗，觀察形成的菌根情況，這對(duì)實(shí)現(xiàn)干巴菌人工栽培有重要意義。在菌塘中可以清晰地觀察到大量的菌根聚集在云南松側(cè)根上，有的菌根被菌絲纏繞。菌根的顏色、分叉類型是初步判斷不同類型外生菌根最直觀的形態(tài)特征，但這些特征會(huì)受到宿主植物、外部環(huán)境等諸多因素的影響，也需要對(duì)菌根與共生植物之間的特殊作用進(jìn)一步開展研究。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干巴菌菌塘自然侵染的云南松幼苗中紅菇屬菌根是主要的菌根類型，形成菌根的概率最高，為14.58%；其次為乳菇屬菌根，概率為10.42%。這與前人研究結(jié)果一致，如謝雪丹等[5]在云南松林幼苗上發(fā)現(xiàn)紅菇類真菌菌根是主要菌根類型。有研究者發(fā)現(xiàn)棉革菌真菌是云南松幼苗主要的共生菌根真菌[13]，但在此次研究中僅發(fā)現(xiàn)棉革菌屬真菌1例。總體來(lái)看，菌塘附近松林的云南松樹齡為30年以上，新播種的云南松樹林為5年以下，經(jīng)分子鑒定外生菌根真菌多樣性較高，共16種不同的大型真菌；云南松林下外生菌根真菌的發(fā)生與分布受氣候、植被、地形、土壤條件和人為干擾等諸多因素影響[14]，其中林齡和近兩年降水減少是影響本研究中外生菌根種類和組成的重要因素；通過(guò)鑒定未發(fā)現(xiàn)干巴菌菌根，這可能與干巴菌菌絲發(fā)育及形成菌根的數(shù)量較少，并未形成優(yōu)勢(shì)菌根有很大關(guān)系，后續(xù)需要進(jìn)一步探索影響干巴菌菌根形成及發(fā)育的因素以獲得干巴菌菌根苗。