廈門市兒童醫(yī)院RSV陽性患者不同檢測方法比較

雷裕 卓志強

[摘要] 目的 了解廈門地區(qū)呼吸道合胞病毒（RSV）感染住院患兒不同檢測方法的特點。方法? 選擇2020年1—10月廈門市兒童醫(yī)院住院的患兒，通過采集患兒鼻咽拭子2份，用熒光免疫方法進行七項呼吸道病毒抗原檢測、PCR方法進行三聯(lián)核酸檢測，以及血清1份用于呼吸道病毒五聯(lián)抗體，收集任一結(jié)果陽性的呼吸道合胞病毒感染患兒91例，通過觀察陽性率結(jié)果對比三種方法的優(yōu)劣。 結(jié)果 91例陽性標本中PCR陽性91例（100%），抗原陽性61例（67.03%），抗體陽性1例（1.11%）。91例RSV感染病例中，診斷為肺炎72例（79.12%），喘息性支氣管炎8例（8.79%），支氣管炎10例（10.99%），傳染性單核細胞增多癥1例（1.10%）。19例（20.88%）混合支原體感染，12例（13.19%）混合卡他莫拉菌感染，8例（8.79%）混合肺炎鏈球菌感染，1例（1.10%）混合流感嗜血桿菌感染。<1歲19例，1～2歲18例，3～4歲39例，>4歲15例。男54例、女37例。平均住院天數(shù)5.9 d。結(jié)論 通過三種不同檢測手段檢測病毒核酸、抗原、抗體，結(jié)果核酸陽性率最高，其次是抗原，抗體陽性率幾乎為0。

[關(guān)鍵詞] 呼吸道合胞病毒;呼吸道感染;兒童;檢測方法

[中圖分類號] R446.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）10-0092-03

[Abstract] Objective To understand the characteristics of different detection methods for Respiratory Syncytial Virus （RSV） infection in hospitalized children in Xiamen. Methods Children hospitalized in Xiamen Children′s Hospital from January to October 2020 were selected. Two nasopharyngeal swabs were collected， seven respiratory virus antigens were detected by fluorescence immunoassay， triple nucleic acid was detected by PCR， one serum sample was used for respiratory virus quintuplet antibody， and 91 children with RSV infection with positive results were collected. The advantages and disadvantages of the three methods were compared by observing the positive rate. Results Among the 91 positive samples， 91 cases were positive for PCR （100%）， 61 cases （67.03%） were antigen-positive， and 1 case （1.11%） was antibody-positive. Among 91 cases of RSV infection， 72 cases （79.12%） were diagnosed as pneumonia， 8 cases （8.79%） as wheezing bronchitis， 10 cases （10.99%） as bronchitis， and 1 case （1.10%） as infectious mononucleosis. There were 19 cases （20.88%） complicated with mycoplasma infection， 12 cases （13.19%） with Moraxella catarrhalis infection， 8 cases （8.79%） with Streptococcus pneumoniae infection and 1 case （1.10%） with Haemophilus influenzae infection. 19 cases were less than 1 year old， 18 cases were 1-2 years old， 39 cases were 3-4 years old， and 15 cases were more than 4 years old. There were 54 boys and 37 girls. The average hospital stay was 5.9 days. Conclusion The virus nucleic acid， antigen and antibody were detected by three different detection methods. The results showed that the positive rate of nucleic acid was the highest， followed by antigen， and the positive rate of antibody was almost zero.

[Key words] Respiratory syncytial virus; Respiratory tract infection; Children; Detection method5F309200-687F-4754-BCEF-BA3E0A6D4908

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）可引起所有年齡段人群的急性呼吸道疾病。幾乎所有兒童在2歲之前都感染過RSV[1]，再感染也較常見。RSV在鼻咽部復制后感染小細支氣管上皮細胞，不感染基底細胞，然后擴展至肺的Ⅰ型和Ⅱ型肺泡細胞，這一過程可能是通過細胞間傳播或吸入分泌物完成;RSV的病理表現(xiàn)包括：上皮細胞壞死、偶有細支氣管上皮細胞增生、聚集于支氣管小動脈和肺小動脈的單核細胞及T細胞浸潤，以及血管結(jié)構(gòu)和小氣道之間的中性粒細胞浸潤。這導致氣道阻塞、空氣滯留和氣道阻力增加，而且與支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)中性粒細胞增多有關(guān)。實驗室提供及時準確的病原檢測報告，對臨床醫(yī)師及時明確病因、控制RSV感染的蔓延、采用特異性針對性治療方案、防止濫用抗生素都具有重大意義[2-6]。本研究選擇通過不同方法的比較從91例RSV感染患兒采用三種不同檢測手段進行數(shù)據(jù)對比，以期能對 RSV的感染提供陽性率高的檢測方法，為臨床醫(yī)師選擇合適的檢測方法提供依據(jù)[7]。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2020年1—10月廈門市兒童醫(yī)院住院的91例患兒為研究對象。納入標準：鼻咽拭子、血清標本、痰液標本，檢測RSV抗原、核酸及抗體，至少1個結(jié)果陽性者。其中男54例，女37例;年齡2個月19 d至5歲7個月，<1歲：19例，1～2歲18例，3～4歲39例，>4歲15例。平均住院天數(shù)5.9 d。

1.2 方法

①呼吸道病毒五聯(lián)抗體檢測：抽取調(diào)查對象靜脈血2 ml，2 h內(nèi)分離血清，采用免疫熒光（IFA）方法檢測血清中肺炎衣原體、肺炎支原體、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及柯薩奇病毒的血清IgM抗體。

②七項呼吸道病原抗原：采用Diagnostic Hybrids，Inc公司生產(chǎn)的七項呼吸道病毒檢測試劑盒（免疫熒光法），主要通過基于熒光標記單克隆抗體的免疫熒光法，對鼻咽吸取液、痰液的呼吸道合胞病毒進行定性檢測。定性檢測：急性呼吸道感染患兒住院7 d內(nèi)留取標本，采用一次性無菌吸痰管吸取1～2 ml深部鼻咽分泌物或痰液，加入少量生理鹽水置于收集管中或行纖維支氣管鏡吸取肺泡灌洗液及時送實驗室行直接免疫熒光（direct immunofluorescence assayk，DFA）檢測[8]。

③三聯(lián)核酸：用無菌的捻拭子或植絨性拭子拭取人鼻咽部分泌物，將鼻咽拭子置入2 ml滅菌的生理鹽水中，立即送檢。采用核酸多重檢測方法檢測患者中腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒三種呼吸道病毒病原體，有效期內(nèi)嚴格按照說明書進行檢測。

1.3 觀察指標

無論是一種還是兼并兩種以上檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性，均視為陽性感染。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測結(jié)果

91例患兒中檢出RSV-RNA陽性91例，陽性檢出率為100.00%，抗原陽性61例（67.03%），抗體陽性1例（1.11%）。見表1。

2.2 臨床特點

91例RSV感染病例中，診斷為肺炎72例（79.12%），喘息性支氣管炎8例（8.79%），支氣管炎10例（10.99%），傳染性單核細胞增多癥1例（1.10%）。19例（20.88%）混合支原體感染，12例（13.19%）混合卡他莫拉菌感染，8例（8.79%）混合肺炎鏈球菌感染，1例（1.10%）混合流感嗜血桿菌感染。<1歲19例，1～2歲18例，3～4歲39例，>4歲15例。男54例，女37例。平均住院天數(shù)5.9 d。

3 討論

兒童90%以上的急性呼吸道感染是由病毒引起的。常見的呼吸道病毒主要包括呼吸道合胞病毒、流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、副流感病毒、人冠狀病毒、鼻病毒等[9-16]。在發(fā)展中國家，RSV感染是所致毛細支氣管炎或肺炎患兒死亡的主要病因之一[17-20];而在美國，每年因RSV感染住院的嬰兒有75 000～125 000例，尤其多見于早產(chǎn)兒及呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)有缺陷的小嬰兒。RSV能在全世界引起季節(jié)性暴發(fā)，每年造成全球100萬以上兒童的死亡。在北半球，暴發(fā)一般出現(xiàn)在10月或11月至次年4月或5月，1月或2月為高峰期。在南半球，冬季RSV感染流行出現(xiàn)在5月至9月，高峰期在5月、6月或7月。幾乎所有兒童在2歲之前都感染過RSV，再感染也較常見。RSV是1歲以下兒童中下呼吸道感染的最常見病因[21]。RSV是一種反義單鏈RNA病毒，屬副黏病毒科。A和B兩種亞型在多數(shù)RSV暴發(fā)中同時出現(xiàn)，A亞型引起的疾病常更嚴重。亞型中有幾種基因型在一個社區(qū)中占據(jù)優(yōu)勢，優(yōu)勢毒株每年輪換，這可能是導致頻繁再感染的原因。RSV主要通過鼻咽黏膜或眼黏膜接觸含病毒的分泌物或污染物而傳播。直接接觸是最常見的傳播途徑，氣溶膠飛沫也可引起傳播。RSV可在手和污染物上存活數(shù)小時。因此，洗手和接觸防護是預防醫(yī)療保健相關(guān)傳播的重要措施[22-23]。RSV感染的潛伏期通常為4～6 d（范圍在2～8 d）。RSV在鼻咽部復制后感染小細支氣管上皮細胞，不感染基底細胞，然后擴展至肺的Ⅰ型和Ⅱ型肺泡細胞，這一過程可能是通過細胞間傳播或吸分泌物完成;1～3 d后出現(xiàn)LRTI（毛細支氣管炎或肺炎）。RSV的病理表現(xiàn)包括：上皮細胞壞死、偶有細支氣管上皮細胞增生、聚集于支氣管小動脈和肺小動脈的單核細胞及T細胞浸潤，以及血管結(jié)構(gòu)和小氣道之間的中性粒細胞浸潤。這導致氣道阻塞、空氣滯留和氣道阻力增加，而且與支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)中性粒細胞增多有關(guān)。

RSV感染的臨床表現(xiàn)因患者年齡、健康狀況以及感染為原發(fā)還是繼發(fā)而異[24]。原發(fā)性感染的嬰幼兒通常表現(xiàn)為LRTI（毛細支氣管炎或肺炎），年齡較大的兒童和成人通常表現(xiàn)為上呼吸道癥狀或氣管、支氣管炎。RSV可在兒童中導致嚴重的下呼吸道疾病、毛細支氣管炎、支氣管痙攣、肺炎和急性呼吸衰竭[25]。下呼吸道疾病常發(fā)生在初次感染時，并可見于50%以上的二次感染。雖然第3次感染之后疾病嚴重程度下降，但即使在健康成人中也有約1/4有LRTI表現(xiàn)。大約20%的嬰兒在出生后的第1年會出現(xiàn)RSV相關(guān)的哮鳴音;2%～3%需要住院治療。RSV反復感染在兒童和年輕成人中頻發(fā)，可導致明顯的上呼吸道癥狀。其表現(xiàn)包括咳嗽、鼻卡他、鼻溢和結(jié)膜炎。與其他呼吸道病毒相比，RSV更可能累及鼻竇和耳。觀察性研究表明，對于90日齡以下的伴RSV感染毛細支氣管炎的發(fā)熱小嬰兒，菌血癥或腦膜炎的風險不到1%～2%;泌尿道感染風險為1%～5%，低于不伴毛細支氣管炎的發(fā)熱嬰兒，但也不能忽視。繼發(fā)性細菌感染在因RSV毛細支氣管炎住院的嬰兒中也不少見。RSV感染通常呈自限性病程，不會導致明顯的長期肺部后遺癥。然而，RSV感染與一些患者的復發(fā)性哮鳴有關(guān)。RSV肺炎導致呼吸衰竭是免疫功能受損宿主中急性發(fā)病和死亡的一個重要原因，在造血干細胞移植患者中報道的死亡率為70%～100%。有研究結(jié)果顯示，RSV感染在肺移植或腎移植患者中似乎不會引起慢性肺功能障礙。5F309200-687F-4754-BCEF-BA3E0A6D4908

對于具有典型毛細支氣管炎的既往體健嬰幼兒，臨床疑診RSV感染通常便足夠。在這類患兒中鑒定RSV不太可能影響治療。如果鑒定RSV會影響臨床治療，則應進行RSV感染的實驗室診斷。RSV的實驗室診斷可通過分析呼吸道分泌物及血清抗體實現(xiàn)。對于健康兒童，鼻腔沖洗的檢出率最高，但如果鼻腔沖洗不可行，鼻咽拭子或咽拭子可能也是適用的。對于插管患者或正接受支氣管鏡檢查的患者，應進行氣管吸引或支氣管肺泡灌洗。確診標準是在HEp-2細胞中分離出RSV。發(fā)現(xiàn)典型的病毒空斑伴合胞體形成，聯(lián)合免疫熒光染色能確診?？衫每乖东@技術(shù)實現(xiàn)快速檢測，不到30 min即可完成。這些檢查具有相對高水平的敏感度和特異度，是大部分臨床實驗室的主要診斷方法。

本實驗數(shù)據(jù)顯示，91例患兒中PCR陽性91例（100%），抗原陽性61例，檢出率67.03%，抗體陽性1例（1.11%）。91例呼吸道合胞病毒（RSV）感染病例中，診斷為肺炎72例（79.12），喘息性支氣管炎8例（8.79%），支氣管炎10例（10.99%），傳染性單核細胞增多癥1例（1.10%）。19例（20.88%）混合支原體感染，12例（13.19%）混合卡他莫拉菌感染，8例（8.79%）混合肺炎鏈球菌感染，1例（1.10%）混合流感嗜血桿菌感染。<1歲19例，1～2歲18例，3～4歲39例，>4歲15例。男54例，女37例。平均住院天數(shù)5.9 d。數(shù)據(jù)顯示呼吸道合胞病毒（RSV）是引發(fā)兒童急性呼吸道疾病常見病原，0～4歲RSV高發(fā)，男女比例相當，RSV可在兒童中導致嚴重的下呼吸道疾病、毛細支氣管炎、支氣管痙攣、肺炎和急性呼吸衰竭，易混合肺炎支原體、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌感染。通過三種不同檢測手段檢測病毒核酸、抗原、抗體，結(jié)果核酸敏感度最高，其次是抗原，抗體在本次實驗中陽性率幾乎為0。

綜上所述，熒光定量RT-PCR熒光探針法檢測核酸和直接免疫熒光檢測病毒抗原的陽性檢出率均高于血清抗體的檢測。熒光定量RT-PCR技術(shù)具有快速、敏感、特異度強等特點，越來越多地應用到醫(yī)學臨床檢測。RT-PCR熒光探針法結(jié)合PCR和熒光探針兩種技術(shù)，具備敏感度高、漏檢率低及特異度高的特點，進一步提高檢測的準確度。直接免疫熒光（DFA）檢測的是RSV抗原，其在感染RSV后產(chǎn)生時間較抗體快，該方法雖然操作簡單，出結(jié)果快，適用于臨床早期檢測。但由于體內(nèi)RSV特異性抗體產(chǎn)生慢，且滴度低，檢測的敏感性不高，因此通過對患者血清抗體測定來診斷RSV感染，不能為臨床醫(yī)師及時提供診療依據(jù)，且這種檢測抗體的免疫學方法反映的是感染的間接指標，不能替代直接的病原學檢測。

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（收稿日期：2021-05-17）5F309200-687F-4754-BCEF-BA3E0A6D4908