鄰苯二甲酸二丁酯毒性試驗(yàn)研究*

徐紅花, 扆雪濤, 方選, 朱愛民, 于德志

(1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111；3.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071)

鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)是聚氯乙烯最常用的增塑劑,是一種確定的內(nèi)分泌干擾素,能引起中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的功能性變化,然后進(jìn)一步引起組織上的改變,有趨肝性,并具有中等程度的蓄積作用和輕度刺激作用,同時(shí),可導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞損傷,孕期使用還可能引起腎臟相關(guān)疾病.在歐美國家已有限制規(guī)定[1-7],但我國在化工行業(yè)、日常生活用品以及醫(yī)用材料中還廣泛使用DBP.研究通過大鼠90 d灌胃毒性試驗(yàn),檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯潛在的毒性,為其機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鄰苯二甲酸二丁酯,西格瑪公司產(chǎn)品(批號(hào)：MKBH5622V)；花生油,桶裝,山東龍大植物油有限公司產(chǎn)品(生產(chǎn)日期：2013-1-16)；血液生化試劑盒,購自北京利德曼生化股份有限公司.

1.2 儀器

Unicel DxC600全自動(dòng)生化分析儀,購自Siemens Healthcare Diagnoseics；L500低速自動(dòng)平衡離心機(jī),購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；JJ2000電子天平,購自美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司常熟市雙杰測(cè)試儀器廠.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠,雄性,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(魯)2009 0009.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 供試品的制備

以花生油作溶劑溶解DPB,分別制成50、200 mg/mL和1 000 mg/mL三個(gè)劑量,供試驗(yàn)用.

1.4.2 分組

選取健康雄性大鼠(體質(zhì)量180～200 g)150只,隨機(jī)分為5組,每組30只.分別為空白對(duì)照組(蒸餾水)、溶劑對(duì)照組(花生油10 mg/kg)、DBP低劑量組(50 mg/kg)、DBP中劑量組(200 mg/kg)和DBP高劑量組(1 000 mg/kg).

1.4.3 給藥

以10 mL/kg的體積灌胃,每天1次,連續(xù)90 d.

1.4.4 檢查項(xiàng)目和頻率

每天給藥后觀察動(dòng)物一般體征,于灌胃給藥的第30天、第60天和第90天分別測(cè)量體質(zhì)量和攝食量后,每組抽取10只動(dòng)物麻醉處死,解剖后稱量主要臟器,并于第90天腹主動(dòng)脈取血測(cè)定血液生化指標(biāo).

1.4.5 檢查指標(biāo)

①一般體征：主要觀察記錄動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、精神、呼吸和胃腸道反應(yīng)等情況.②體質(zhì)量和攝食：灌胃給藥的第30天、第60天和第90天分別測(cè)量體質(zhì)量和攝食量.③血液生化指標(biāo)：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)、肌酸磷酸激酶(CK)、總膽固醇(CHOL)和甘油三酯(TG).④臟器質(zhì)量：稱量解剖后動(dòng)物的腦、心、肝、腎、腎上腺、胸腺、胰、肺、睪丸和附睪的質(zhì)量,計(jì)算睪丸和附睪的臟器系數(shù).

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；對(duì)滿足正態(tài)分布、方差齊和方差分析檢驗(yàn)結(jié)果顯著的數(shù)據(jù),采用LSD檢驗(yàn),非正態(tài)分布或方差不齊數(shù)據(jù),采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),并對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較；自身對(duì)照比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)和兩個(gè)相關(guān)樣本檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

給藥期間,DBP低、中、高劑量組動(dòng)物在給藥1周后,逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少和豎毛的癥狀,高劑量組表現(xiàn)最明顯,此外各組動(dòng)物未見其他明顯的全身毒性反應(yīng).

2.2 體質(zhì)量

DBP高劑量組大鼠體質(zhì)量給藥60 d與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組比較有降低趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，給藥90 d明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，其余各組比較無顯著差異，見表1.

表1 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

2.3 攝食

低、中、高劑量組大鼠攝食量給藥60 d與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組比較有降低趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；給藥90 d DBP高劑量組攝食量明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)和溶劑對(duì)照組(P<0.05)，其余各組比較無顯著差異(見表2).

表2 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠攝食量的影響

2.4 臟器質(zhì)量

2.4.1 對(duì)大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸系數(shù)的影響

DBP高劑量組大鼠灌胃90 d解剖后,肉眼可見睪丸與空白對(duì)照組比較明顯縮小(圖1),其質(zhì)量與其他組比較明顯降低,且低于同組30 d和60 d時(shí)的睪丸質(zhì)量,統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P<0.01)；DBP高劑量組灌胃30 d和60 d睪丸質(zhì)量與其他各組比較有降低趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表3.

DBP高劑量組大鼠灌胃90 d睪丸系數(shù)與其他組比較明顯降低,組間比較有顯著性差異(P<0.01)；高劑量組大鼠灌胃90 d睪丸系數(shù)與同組灌胃30 d和60 d睪丸系數(shù)比較明顯降低(P<0.01).其他各組未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表4).

表3 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠睪丸重量的影響

表4 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠睪丸系數(shù)的影響

2.4.2 對(duì)大鼠附睪質(zhì)量和附睪系數(shù)的影響

DBP高劑量組大鼠灌胃90 d解剖后,肉眼可見附睪與空白對(duì)照組比較明顯縮小(圖1),其質(zhì)量與其他組比較明顯降低(P<0.01)；DBP高劑量組大鼠灌胃90 d時(shí)附睪質(zhì)量與同組灌胃30 d和60 d比較有降低趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表5).

DBP高劑量組大鼠灌胃90 d時(shí)附睪系數(shù)與其他組以及與同組灌胃30 d和60 d比較均有降低趨勢(shì),但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表6).

表5 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠附睪質(zhì)量的影響

表6 DBP 90天灌胃對(duì)大鼠附睪系數(shù)的影響

(a)空白對(duì)照組大鼠睪丸和附睪解剖后外觀圖 (b)DBP高劑量組大鼠睪丸和附睪解剖后外觀圖

2.4.3 對(duì)其他臟器質(zhì)量的影響

DBP經(jīng)90 d灌胃,對(duì)大鼠腦、心、肝、腎、腎上腺、胸腺、胰和肺的臟器質(zhì)量無影響(見表7).

表7 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響

2.5 對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

DBP高劑量組堿性磷酸酶和肌酐濃度高于溶劑對(duì)照組,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素和肌酸激酶濃度低于空白對(duì)照組,DBP低、中、高劑量組甘油三酯低于空白和溶劑對(duì)照組,DBP低、高劑量組總膽固醇低于溶劑對(duì)照組,組間比較分別有顯著性差異(P<0.01),詳細(xì)結(jié)果見表8.

表8 DBP 90 d灌胃對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

3 討論

在90 d給藥的過程中,隨給藥天數(shù)的增加,給藥組大鼠外觀狀態(tài)明顯較差,其中DBP高劑量組動(dòng)物最明顯.這與其體質(zhì)量、攝食、臟器質(zhì)量及系數(shù)以及血液生化檢測(cè)結(jié)果吻合.在解剖時(shí)肉眼可見睪丸和附睪的萎縮及變形,表明DBP對(duì)生殖系統(tǒng)的危害明顯；另外,多項(xiàng)血液生化指標(biāo)的明顯改變表明DBP在一定劑量下會(huì)導(dǎo)致大鼠代謝的紊亂以及誘發(fā)多系統(tǒng)、多功能的臟器損傷,因未進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,故可能導(dǎo)致?lián)p傷的臟器，以及損傷的嚴(yán)重程度還需進(jìn)一步研究.

雖一般認(rèn)為AST的降低并沒有臨床意義,但就本研究來看,DBP會(huì)導(dǎo)致多種酶的明顯變化；同時(shí)文獻(xiàn)資料表明,AST的降低與維生素B6和鋅的缺乏有密切的關(guān)系[8],大鼠的相關(guān)研究也表明,維生素B6的缺乏可以導(dǎo)致生殖系統(tǒng)功能的破壞,而鋅元素則大量存在于男性睪丸中,參與精子生成、成熟和獲能等整個(gè)過程[9].因此,對(duì)于DBP是否會(huì)影響機(jī)體維生素B6和鋅等元素代謝,并由此引起生殖系統(tǒng)損傷有待進(jìn)一步研究.