基因VI型新城疫病毒熒光RT-PCR檢測方法的建立與應用

王靜靜，于曉慧，克軍宏，2，彭真奇，3，邢安琪，4，劉華雷

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.塔里木大學，新疆阿拉爾 843300；3.安徽農業(yè)大學，安徽合肥 230036；4.寧夏大學，寧夏銀川 750021）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強毒株感染引起的一種禽的急性、高度接觸性傳染病，是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經濟損失。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。NDV 具有遺傳多樣性，根據病毒F基因差異可分為I 和II 兩大類，I 類NDV 只有1 個基因型，均為弱毒株；II 類NDV 至少包括21 種基因型，其中既有弱毒株也有強毒株[1]。目前我國流行的強毒株主要為基因VI型和VII型，且病毒具有明顯的宿主特異性[2-3]。20 世紀80 年代后，基因VI型NDV 傳至世界各地，并一直在鴿群中流行和傳播[4-5]。國家新城疫參考實驗室監(jiān)測數據顯示，近年來我國鴿群NDV 強毒陽性率呈上升趨勢[6]，提示應對鴿群中基因VI型NDV 強毒株加以關注。

目前，我國ND 診斷主要依靠RT-PCR 結合測序。NDV 強毒鑒定可通過測定1 日齡雛雞腦內接種致病指數（ICPI）或病毒F 蛋白裂解位點序列分析進行，通過病毒F 蛋白裂解位點堿性氨基酸數量判定病毒毒力。該方法檢測周期較長，無法滿足快速檢測的需求。此外，多家實驗室也建立了NDV強毒株熒光RT-PCR 檢測方法[7-9]，用于NDV 強毒株的快速篩查，但這些方法均無法區(qū)分病毒基因型，所以目前仍無專門針對基因VI型NDV 的快速檢測方法。為了滿足基因VI型NDV 的檢測需求，本研究針對NDVF基因設計特異性引物和探針，建立了一種特異性強、敏感性高、快速有效的基因VI型NDV 檢測方法，為開展鴿群ND 的早期診斷提供了重要支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 I 類（基因1.1.2 亞型）、II 類（基因I型、II型、VI型、VII型）NDV、禽流感病毒（H5、H7、H9 亞型）、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、減蛋綜合征病毒、禽腦脊髓炎病毒等，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心禽病監(jiān)測室保存。

1.1.2 臨床樣品 120 份鴿口咽/泄殖腔拭子，由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心禽病監(jiān)測室保存。

1.1.3 試劑盒 High Pure Viral Nucleic Acid Kit核酸提取試劑盒，購自Roche 公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 RT-PCR 試劑盒，購自TaKaRa 公司；SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit 熒光RT-PCR 試劑盒，購自Invitrogen公司。

1.1.4 cRNA 標準品 基因VI型NDV cRNA 標準品，由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心禽病監(jiān)測室制備和保存。

1.1.5 雞胚 9～11 日齡SPF 雞胚，購自山東濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物、探針設計和篩選

從GenBank 上下載NDVF基因序列，采用MEGA 6 進行序列比對分析，選取基因VI型NDV保守區(qū)域設計特異性引物和探針（表1）。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 熒光RT-PCR 引物和探針

1.3 病毒核酸提取

按照核酸提取試劑盒說明書操作，提取病毒核酸，立即用于實時熒光RT-PCR 或RT-PCR 擴增，或置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 反應體系建立與優(yōu)化

以提取的基因VI型NDV RNA 為模板，按照實時熒光RT-PCR 試劑盒說明書配置反應體系，進行熒光RT-PCR 擴增，確定最佳引物和探針濃度以及退火溫度和時間。

引物探針濃度優(yōu)化：固定反應體系引物終濃度為0.5 μmol/L，探針濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 和0.50 μmol/L。根據檢測Ct 值確定最佳探針濃度。

退火溫度優(yōu)化：退火溫度分別設置為58、59和60 ℃，通過比較Ct 值確定最佳退火溫度。

退火時間優(yōu)化：退火時間分別設置為30、40、50、60 和70 s，通過檢測Ct 值確定最佳退火時間。

1.5 特異性試驗

選擇具有代表性的12株基因VI型NDV，以及I 類（基因1.1.2 亞型）、II 類（基因I型、II型、VII型）NDV、禽流感病毒（H5、H7、H9 亞型）、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、減蛋綜合征病毒、禽腦脊髓炎病毒，提取核酸進行熒光RT-PCR擴增，評價方法的特異性。

1.6 敏感性試驗

將基因VI型NDV cRNA 標準品進行10 倍倍比稀釋，取濃度為5×109～5×100copies/μL 的樣品進行熒光RT-PCR 擴增，每個稀釋度做3 個重復。

1.7 臨床樣品檢測

用建立的熒光RT-PCR 方法對臨床采集的120份鴿口咽/泄殖腔拭子樣品進行檢測，并與病毒分離方法（病毒繁殖、RT-PCR 擴增和序列分析）檢測結果進行比較。

2 結果

2.1 反應體系建立和優(yōu)化

以基因VI型NDV RNA 為模板進行熒光RT-PCR 擴增，優(yōu)化反應體系和反應條件。確定的最終反應體系：2×Reaction Mix 10.0 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，RTTaqMix 0.5 μL，模板RNA 2.0 μL，DEPC 水6.0 μL，總體積20.0 μL。反應條件：50 ℃30 min，95 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45 次循環(huán)。每次循環(huán)在60 ℃時收集熒光信號。

2.2 特異性試驗

用國內流行的5 種基因型NDV 和其他9 種常見禽病病毒核酸進行特異性試驗。結果（圖1）顯示：只有12株基因VI型NDV 核酸經熒光RTPCR 擴增后出現(xiàn)特異性擴增曲線，基因1.1.2 亞型、基因I型、II型NDV 弱毒，基因VII型NDV 強毒，以及其他常見禽病病毒核酸經熒光RT-PCR 擴增后均無擴增曲線。

2.3 敏感性試驗

以濃度為5×109～5×100copies/μL 的cRNA樣品進行熒光RT-PCR 擴增，每個稀釋度做3 個重復。結果（圖2）顯示，熒光RT-PCR 檢測下限為5 copies/μL。

2.4 臨床樣品檢測

用建立的熒光RT-PCR 方法對臨床采集的120份鴿口咽/泄殖腔拭子樣品進行檢測，結果檢出陽性樣品17 份，檢測結果與病毒分離方法完全一致，說明本研究建立的熒光RT-PCR 方法可信度高，可用于臨床樣品中基因VI型NDV 檢測。

3 討論

ND 是影響我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。目前我國流行的NDV 強毒株分屬3 個基因型，即基因型VI型、VII型和XII型。其中，基因VII型和XII型NDV 分別在雞群和鵝群中流行，基因VI型NDV 在鴿群中流行?；騐I型NDV 曾被稱為鴿副黏病毒I型（pigeon paramyxovirus type 1，PPMV-1），是雞源NDV 跨種傳播至鴿后產生的變異株，也是導致全球第三次ND 大流行（20 世紀70 年代后期至80 年代）的主要流行毒株[10]。20 世紀80 年代我國首次分離到基因VI型NDV，隨后該基因型毒株一直在我國鴿群中流行。國家新城疫參考實驗室監(jiān)測數據顯示，近十年間鴿NDV強毒陽性率明顯高于雞和水禽，且近兩年基因VI型NDV 流行強度明顯升高?；騐I型NDV 在我國分布廣泛[2，5，11]，沒有明顯的地域性，已經成為我國當前流行最為廣泛的強毒株，也是危害養(yǎng)鴿業(yè)健康發(fā)展的主要病原之一。因此，需要加強基因VI型NDV 的監(jiān)測預警，建立快速靈敏特異的檢測方法，為鴿ND 的早期診斷提供技術儲備。

目前，ND 弱毒活疫苗的普遍使用和弱毒株的大量存在[12-13]，給ND 確診帶來巨大挑戰(zhàn)。由于NDV 只有一個血清型，單純檢測NDV 的血清學方法（血凝抑制試驗）和強弱毒通用的RT-PCR 技術已無法滿足快速確診和早期診斷的需求。ND 確診需要依靠病毒致病性評價。傳統(tǒng)的毒力測定方法為生物學試驗，即ICPI 測定，此方法檢測周期長，且需要一定級別的生物安全實驗室，不適合大規(guī)模推廣應用。目前，病毒毒力鑒定常用常規(guī)RT-PCR技術結合序列分析，但測序所需時間較長，無法滿足快速檢測的需求。近年來，反轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）和熒光RT-PCR 等分子生物學技術也被用于NDV 檢測[8，14-15]，但現(xiàn)有方法主要是針對疫苗毒和基因VII型、IX型強毒株。本研究建立了一種基因VI型NDV 熒光RT-PCR 檢測方法，可在2.5～3 h 內完成樣品檢測，具有操作簡單、特異性強、敏感性高、準確性好等優(yōu)點，適用于大批量臨床樣品檢測。