浙江省寧波市大黃魚病原菌分離鑒定及其耐藥性分析

葛明峰，金晗，柳海，徐勝威，許昊川，王雯瓊，沈偉良

（1.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315000；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023）

我國大黃魚（Pseudosciaena crocea）養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動了飼料、交通運(yùn)輸、餐飲服務(wù)等相關(guān)上下游產(chǎn)業(yè)，創(chuàng)造了巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。但隨養(yǎng)殖量的攀升，受養(yǎng)殖密度增大，以及水體負(fù)載飽和及污染加重，管理水平低和技術(shù)規(guī)范欠科學(xué)等諸多因素影響，養(yǎng)殖大黃魚病害頻發(fā)，且呈日益加重趨勢[1-2]。

據(jù)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，我國2020 年大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)25.4 萬t，為海水養(yǎng)殖魚類第一，而因病害造成的經(jīng)濟(jì)損失約為5.0 億元，其中由細(xì)菌性疾病造成的危害最為嚴(yán)重[3-4]。對大黃魚細(xì)菌性病害進(jìn)行監(jiān)測，不僅能夠較系統(tǒng)地掌握細(xì)菌病害的發(fā)生規(guī)律、分布及其程度等，更能及時、有效地預(yù)防與控制細(xì)菌病害，將其所造成的損失降到最低[5]。

同時，為推進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于實(shí)施2021 年水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖“五大行動”，達(dá)到用藥減量的目的，對分離的病原菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以掌握其對不同漁藥的耐藥性及其變化規(guī)律，豐富當(dāng)?shù)丶叭珖簏S魚養(yǎng)殖區(qū)域病原菌耐藥譜庫，為科學(xué)、規(guī)范、精準(zhǔn)、合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

2021 年4—10 月，每月在象山西滬港、三門灣大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖海區(qū)進(jìn)行1 次例行采樣檢測，并同時對寧波市其他大黃魚養(yǎng)殖場，如發(fā)生細(xì)菌性疾病的場進(jìn)行應(yīng)急采樣檢測。每次每個養(yǎng)殖點(diǎn)現(xiàn)場采集臨床癥狀明顯的活體或?yàn)l臨死亡的個體5～10 尾，共采集大黃魚93 尾。

1.2 主要試劑與材料

牛腦心浸出液固體培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA 提取試劑盒，Omega Biotek 公司產(chǎn)品；2×TaqMasterMix（含染料），Takara Bio 公司產(chǎn)品；16S rDNA 引物，由北京華大基因科技有限公司合成；藥敏檢測分析試劑盒、試劑板，南京菲恩醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

無菌條件下，取魚肝、脾、腎等組織劃線接種于牛腦心浸出液固體平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h（鰤魚諾卡氏菌需培養(yǎng)5～7 d）；挑取單菌落純化培養(yǎng)后，提取細(xì)菌DNA。根據(jù)16S rDNA 序列設(shè)計(jì)引物，建立PCR 擴(kuò)增體系[6]。PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果由北京六合華大基因科技股份有限公司提供，經(jīng)GenBank Blast 數(shù)據(jù)比對后進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病原微生物耐藥性普查工作要求，選定硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶、“磺胺甲噁唑+甲氧芐啶”等8 種抗菌藥物。根據(jù)藥敏檢測分析試劑盒、試劑板操作說明，得到各藥物對菌株的最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC），計(jì)算中位值MIC50，然后進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

2.1.1 細(xì)菌種類 2021 年1—10 月從采集的93 尾大黃魚中分離到6 種細(xì)菌，共25株（表1）。其中：殺香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）8株，占總菌株數(shù)的32%（8/25）；三類弧菌10株，包括溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）各4株，副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）2株，占總分離菌數(shù)的40%（10/25）；另有5株鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolea）和2株美人魚發(fā)光桿菌（Photobacterium），占比分別為20%（5/25）和8%（2/25）。這25株菌株從象山地區(qū)分離到20株（西滬港13株、三門灣7株），鄞州和奉化地區(qū)各分離到2株，寧海分離到1株。

表1 2021 年1—10 月分離到的細(xì)菌種類及數(shù)量 單位：株

2.1.2 分離地點(diǎn)與時間 共分離到殺香魚假單胞菌8株，其中1 月（水溫21 ℃）于鄞州區(qū)室內(nèi)水泥池發(fā)病大黃魚上分離到2株，4—5 月在象山網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚上陸續(xù)分離到6株（4 月、5 月西滬港各2株，三門灣各1株），發(fā)病水溫普遍為18～22 ℃。分離到弧菌10株（奉化、象山西滬港、三門灣分別2株、5株、3株），其中溶藻弧菌4株、哈維氏弧菌4株、副溶血弧菌2株，且采樣時間集中在5、7、8 月。5 月，從象山西滬港同一批魚組織上不僅分離到1株溶藻弧菌，同時還分離到2株美人魚發(fā)光桿菌，表現(xiàn)為混合感染。8—10 月，共分離到5株鰤魚諾卡氏菌，其中8—9 月從寧海、象山地區(qū)各分離到2株，10 月從象山西滬港分離到1株。

2.2 細(xì)菌耐藥性分析

2.2.1 不同病原菌對藥物的耐藥性 通過統(tǒng)計(jì)MIC50得到的結(jié)果見表2。分析可知，殺香魚假單胞菌的耐藥性普遍大于其他5 種細(xì)菌，特別是對酰胺醇類（甲砜霉素、氟苯尼考）及磺胺類藥物（磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶）的MIC50高于其他病原菌。3 種弧菌對不同藥物的耐藥性基本一致，除對恩諾沙星和甲砜霉素略有差異外，對其他6 種藥物的MIC50則完全相同，且與其他3 種病原菌相比，弧菌對藥物的敏感性更強(qiáng)。美人魚發(fā)光桿菌和鰤魚諾卡氏菌都對鹽酸多西環(huán)素最為敏感，與3 種弧菌的耐藥性類似。從抗菌藥物種類分析，2 種磺胺類藥物對不同病原菌的抑制作用較強(qiáng)（殺香魚假單胞菌除外），鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹對溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、美人魚發(fā)光桿菌及鰤魚諾卡氏菌都有極好的抑制作用，除氟甲喹對美人魚發(fā)光桿菌MIC50為4.00 mg/L 外，這兩種藥物對5 種菌的MIC50均小于最低試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度。另外，恩諾沙星、硫酸新霉素的抑菌效果也普遍較好，MIC50為0.13～4.00 mg/L；而酰胺醇類的甲砜霉素、氟苯尼考抑菌效果一般，尤其是對殺香魚假單胞菌的MIC50≥200 mg/L。

表2 各病原菌對不同藥物的耐藥性（MIC50） 單位：mg/L

2.2.2 同種病原菌對藥物的耐藥性 對不同采樣時間、不同養(yǎng)殖地區(qū)大黃魚上分離到的殺香魚假單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各菌株對同一藥物的耐藥性并不完全一致（表3）。除了磺胺間甲氧嘧啶和“磺胺甲噁唑+甲氧芐啶”這2 種藥物對4株病原菌的MIC 相同外，其他6 種藥物對不同時間分離到的殺香魚假單胞菌的抑菌效果均有一定差異。其中，5 月16 日從象山三門灣分離的菌株對氟甲喹的敏感性高于其他株菌；1 月15 日從鄞州室內(nèi)水泥池養(yǎng)殖大黃魚上分到的菌株對恩諾沙星敏感性高于其他株菌?？傮w而言，4 月2 日從象山西滬港網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚體上分離到的殺香魚假單胞菌對8種藥物的耐受性普遍高于其他3 個菌株。這表明從不同時間、不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖模式大黃魚上分離到的殺香魚假單胞菌對藥物的耐藥性存在一定差異。

表3 不同時間分離到的殺香魚假單胞菌對不同藥物的耐藥性（MIC50） 單位：mg/L

3 討論

細(xì)菌病一直是困擾大黃魚健康養(yǎng)殖的一類疾病，其中以弧菌?。ㄆつw潰瘍?。┚佣?，危害最大[7]。李清祿等[8]對引起福建省網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚弧菌病的病原菌鑒定為鰻弧菌和副溶血弧菌，且鰻弧菌占51%。這與本研究結(jié)果有一定差異，本研究未分離到鰻弧菌，這可能跟福建省區(qū)域的水溫、鹽度較寧波市高等環(huán)境差異導(dǎo)致水體中優(yōu)勢菌群不同有關(guān)。殺香魚假單胞菌是引起寧波市大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的主要病原[9-10]。有研究[11-13]對寧德市大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)致病菌也為假單胞菌屬細(xì)菌。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從象山西滬港魚體上分離到的菌株數(shù)及細(xì)菌種類均高于三門灣。這可能跟兩者所處地理位置有關(guān)，三門灣更靠近象山港口，水流速度快，且該區(qū)域養(yǎng)殖密度低，養(yǎng)殖環(huán)境整體優(yōu)于西滬港，因而細(xì)菌感染及疾病的發(fā)生都較后者低。

大黃魚細(xì)菌病流行時間大多在4—10 月，其中5—9 月為流行高峰期[7]。從不同病原菌的分離時間分析，4—5 月是大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的高發(fā)期，隨著水溫升高，該病有所緩減。5—8 月由于梅雨、高溫等惡劣天氣影響，且隨著水溫上升，細(xì)菌迅速繁殖，水質(zhì)加劇惡化，易發(fā)生弧菌病等多種細(xì)菌疾病。如這一時期分離到的美人魚發(fā)光桿菌和3 種弧菌，都是海水中常見的條件致病菌[14-15]，其感染魚體的主要原因是目前網(wǎng)箱養(yǎng)殖集約化程度高，養(yǎng)殖密度大，導(dǎo)致魚體容易損傷，免疫力下降。本次調(diào)查在6 月未分離到任何菌株，推測可能跟5 月細(xì)菌集中感染后養(yǎng)殖戶注重水體消毒并內(nèi)服抗生素等積極的防控措施有關(guān)，亦或跟采樣點(diǎn)的局限性有關(guān)。8—10 月為大黃魚諾卡氏菌病發(fā)病高峰期，該菌從2006 年在網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚被發(fā)現(xiàn)后[16-17]，便一直危害魚體，尤其近幾年對寧波市大黃魚養(yǎng)殖造成了較為嚴(yán)重影響，雖然日死亡量不大，但影響時間長。由上述分析可知，大黃魚細(xì)菌性疾病的發(fā)生種類與水溫存在一定的相關(guān)性。另有研究[18]表明，福建省等大黃魚養(yǎng)殖地區(qū)也時常發(fā)生上述疾病，但流行時間略有差異，如內(nèi)臟白點(diǎn)病在寧德市的發(fā)病期往往為11 月至次年5 月，而寧波市11 月至次年2 月很少發(fā)現(xiàn)該病。這主要跟水溫有關(guān)，該時期寧波市水溫較低，養(yǎng)殖戶往往將大黃魚運(yùn)往溫州、福建等水溫較高的地區(qū)越冬。

從細(xì)菌耐藥性結(jié)果可知，鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、恩諾沙星對大部分病原菌的抑制效果較好，可作為防治大黃魚細(xì)菌病的首選藥物。但考慮到寧波市養(yǎng)殖區(qū)域鹽酸多西環(huán)素及恩諾沙星使用較普遍且頻繁，建議養(yǎng)殖戶可用氟甲喹替代，實(shí)行輪換用藥，以避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[19]?；前奉愃幬锱c增效劑甲氧芐啶合用療效更佳[5]。病原菌對磺胺類藥物的MIC50較前幾年大幅下降，這可能是由于近幾年寧波市大黃魚養(yǎng)殖區(qū)域較少使用磺胺類藥物，亦或與菌株耐藥性的自然消失有關(guān)，但對該類藥物敏感性還需持續(xù)跟蹤監(jiān)測，以準(zhǔn)確掌握其變化規(guī)律。另外，不同時間、不同地區(qū)魚體上分離到的殺香魚假單胞菌對藥物的耐藥性并非完全一致，這可能跟菌種存在不同亞種以及各養(yǎng)殖地區(qū)用藥狀況有關(guān)。因此即使針對同種細(xì)菌，在藥物選擇及劑量上也應(yīng)參考藥敏試驗(yàn)結(jié)果而定，不可僅憑經(jīng)驗(yàn)或照搬書本[20]。但要指出的是，MIC50雖然是評價病原菌對抗菌藥物敏感性的主要指標(biāo)，是選擇有效抗菌藥物的重要依據(jù)，但體外試驗(yàn)與魚體內(nèi)環(huán)境還存在一定差異。因此，要制訂有效的治療方案，達(dá)到最佳的療效，還應(yīng)結(jié)合藥代動力學(xué)、藥效學(xué)等參數(shù)。

病原菌耐藥性監(jiān)測對科學(xué)精準(zhǔn)用藥，推動水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖及用藥減量具有十分重要的意義。之前關(guān)于大黃魚細(xì)菌耐藥性的分析大多集中于福建省寧德市[21-22]，而本研究進(jìn)一步豐富了大黃魚病原菌耐藥性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，擴(kuò)大了耐藥性譜庫，有利于在相關(guān)疾病發(fā)生時做出快速判斷并采用相應(yīng)的藥物進(jìn)行防控，避免亂用、濫用藥物，從而降低病原微生物耐藥性。同時，養(yǎng)殖戶還應(yīng)嚴(yán)格遵守《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》（2020 年1、2 號）相關(guān)規(guī)定，并嚴(yán)格執(zhí)行休藥期制度，避免魚體藥物殘留超標(biāo)，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。