云南省江城縣山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒檢測(cè)及序列分析

張娜西，孟錦昕，李釗，何于雯，王德瓊，李楠，孫建美，白方，王靜林

（1.江城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南江城 665900；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；3.江城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村和科學(xué)技術(shù)局，云南江城 665900）

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（enzootic nasal tumor，ENT）是由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（enzootic nasal tumor virus，ENTV）感染引起山羊鼻內(nèi)黏膜上皮細(xì)胞異常增生的一種慢性、進(jìn)行性、傳染性腫瘤疾病[1]，臨床主要表現(xiàn)為食欲減退、日益消瘦、運(yùn)動(dòng)減少、呼吸困難，最終因呼吸衰竭而死亡，病死率最高可達(dá)100%，對(duì)山羊健康養(yǎng)殖危害較大[2-4]。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，除大洋洲外，其他大洲均有分布，不同地區(qū)的發(fā)病率為0.1%～15.0%[5-11]。1975 年內(nèi)蒙古赤峰市首次報(bào)道了ENT 流行[12]，隨后湖南、四川、陜西、福建、貴州、安徽、重慶、廣西和廣東等地區(qū)相繼報(bào)道了該病的流行，發(fā)病率為0.5～40.0%[4，13-21]。近年來(lái)，該病在我國(guó)山羊中的流行呈明顯上升趨勢(shì)。目前，在云南省尚未有發(fā)現(xiàn)ENT 病例的報(bào)道。本研究對(duì)2017年在云南省南部邊境地區(qū)江城縣采集的羊全血樣本進(jìn)行了隨機(jī)PCR（random PCR）擴(kuò)增以及ENTV檢測(cè)，并對(duì)測(cè)序獲得的基因序列進(jìn)行了分析，明確云南省江城縣存在ENTV 流行，這為云南省進(jìn)一步開(kāi)展ENT 調(diào)查以及山羊呼吸道疾病的診斷和預(yù)防提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和保存

2017 年8 月在江城縣寶藏鄉(xiāng)一農(nóng)戶(hù)養(yǎng)殖的山羊群中，采用真空采血管，從山羊頸靜脈采集血液，每只山羊采集肝素抗凝血5 mL，顛倒混勻后，4 ℃保存帶回實(shí)驗(yàn)室，3 000 r/min 離心5 min，取出上清（血漿）分裝成每管500 μL，-85 ℃冰箱保存。

1.2 隨機(jī)PCR 擴(kuò)增

從冰箱中取出山羊血漿樣本，每份取出200.0 μL 加到同一離心管中，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜（Millipore 公司）過(guò)濾，38 000g超離2 h，用200.0 μL 滅菌PBS 重懸，用QIAamp Viral RNA Mini Kit（美國(guó)QIAGEN 公司），按說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行隨機(jī)PCR 擴(kuò)增：以20 μmol/L K2Sr（5′-GACCATCTAGCGACCTCCACNNNNNN-3′）為引物，采用PrimeScript ?RT reagent Kit 試劑盒（TakaRa 公司，大連）合成cDNA 第一鏈；94 ℃ 2 min 預(yù)變性第一鏈cDNA，加入0.5 μL Klenow 酶（5 U/μL，TakaRa 公司，大連）合成cDNA 第二鏈。以3.0 μL 合成的cDNA為模板，K2S（5′-GACCATCTAGCGACCTCCAC-3′）為特異性引物，作隨機(jī)PCR 擴(kuò)增。在反應(yīng)體系中依次加入焦碳酸二乙酯處理水（DEPC）38.5 μL、10×Ex-Taq緩沖液5.0 μL、K2S（20 μmol/ L）1.5 μL、dNTP（10 mmol/L）1.5 μL、Ex-Taq酶（5 U/μL）0.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min、65 ℃ 3 min，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min。將隨機(jī)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收＞500 bp 的片段；采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TakaRa 公司，大連）進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物與載體pMD19-T（TakaRa 公司，大連）連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞；取2.0 μL 菌液作模板，用KS 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（58 ℃退火，共25 個(gè)循環(huán)），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)載體中有無(wú)插入片段；將有插入片段的克隆，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進(jìn)行測(cè)序；將獲得的序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）資料庫(kù)中進(jìn)行BLAST 在線比對(duì)，確定插入序列來(lái)源。

1.3 ENTV RT-PCR 檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照ENTV-2 CHN1（KU258870）全基因序列，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)3條引物（ENTV5375F：5′-TCCCGGAGAGGCTGGTACGC-3′；ENTV6036R：5′-GGTGCCCAATCCCATAAAAGG-3′；ENTV6020R：5′-AAAGGGTGGCATCGGCGTTG-3′），用于半巢式RT-PCR 擴(kuò)增病毒env基因。第一輪擴(kuò)增目的基因片段大小為662 bp，第二輪為646 bp，引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 病毒RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈和RT-PCR 從-85 ℃冰箱中取出山羊血漿樣品，用QIAamp Viral RNA Mini Kit（美國(guó)QIAGEN 公司）試劑盒提取每份血漿樣品的病毒RNA，制備cDNA。每份樣品取2.00 μL cDNA 作為反應(yīng)模板，首先采用ENTV 5375F 和6036R 引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，依次加入10×Buffer 5.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5.00 μL，上下游引物各1.25 μL，Ex-Taq酶0.75 μL，去離子水31.75 μL，充分混勻。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后取2.00 μL 第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，采用ENTV 5375F 和6020R 引物，按照第一輪擴(kuò)增的體系和條件進(jìn)行第二輪擴(kuò)增；對(duì)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增，擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)序。

1.4 序列分析

使用MEGA X 軟件中的AlING 進(jìn)行病毒基因核苷酸序列比對(duì)，DNAstar 軟件中的MegAlign 進(jìn)行核苷酸同源性分析；使用MEGA X 軟件完成基于最大似然法（ML）方法的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)繪制，篩選最佳模型，bootstrap 值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿樣品隨機(jī)PCR 擴(kuò)增

采用隨機(jī)PCR 對(duì)20 份羊血漿樣品進(jìn)行擴(kuò)增、克隆測(cè)序，獲得序列經(jīng)Blastn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)克隆分別獲得452 個(gè)核苷酸（nt）和305 個(gè)nt 的序列，與Betaretrovirus屬ENTV 2型（ENTV-2）中國(guó)福建流行株ENTV/CH/GT/2015（MK210250）和四川流行株ENTV-2CHN1（KU258870）同源性最高，為98.0%～99.0%，提示該批羊群中存在ENTV-2 感染。

2.2 血漿樣品巢式PCR 擴(kuò)增及氨基酸差異位點(diǎn)分析

對(duì)20 份山羊血漿樣品采用巢式PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果4 份樣品（編號(hào)JC47、JC48、JC50 和JC57）擴(kuò)增為陽(yáng)性（4/20）。對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序共獲得4 條570 個(gè)nt 的序列，編碼190 個(gè)氨基酸。氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，4 份樣品的ENTV env 蛋白186 位和204 均發(fā)生“G →E”氨基酸突變，而這2 個(gè)氨基酸位點(diǎn)在我國(guó)其他地方流行的ENTV、綿羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）上均保守；此外，JC57 樣品序列上的env蛋白178 位還發(fā)生了“T →P”的氨基酸突變（圖1）。

2.3 ENTV env 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序獲得的4 條ENTVenv基因序列與18條GenBank中下載的ENTV-2、ENTV-1 和JSRV相應(yīng)序列一起進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。進(jìn)化分析結(jié)果（圖2）顯示，獲得的4 條序列形成一個(gè)較小的進(jìn)化簇。它們之間的核苷酸同源性為98.6%～99.8%，氨基酸同源性為99.5%～100%（表1）；這4 條序列與我國(guó)四川、福建等地流行的ENTV-2 形成一個(gè)較大的進(jìn)化簇，核苷酸同源性為96.3%～99.5%，氨基酸同源性為95.3%～99.0%，而與ENTV-1 和JSRV 形成不同的進(jìn)化分支，核苷酸同源性低于93.7%，氨基酸同源性低于95.8%。

表1 ENTV 部分env 基因核苷酸及其編碼氨基酸同源性分析結(jié)果 %

3 討論

近年來(lái)ENT 在全球范圍的流行呈上升趨勢(shì)。該病的發(fā)病率不高（0.1%～15.0%），但病死率非常高，幾乎為100%[5-6，21]，對(duì)山羊健康危害非常嚴(yán)重。特別是近年來(lái)隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，羊肉需求及養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加，ENT流行范圍不斷擴(kuò)大，流行頻率不斷增強(qiáng)[21]。在云南省周邊的四川、重慶、貴州和廣西等地區(qū)的羊群中均有ENT 流行的報(bào)道[15-16，18，20-21]。本研究首次在云南省江城縣山羊群中檢測(cè)到了ENTV-2，發(fā)現(xiàn)其遺傳進(jìn)化關(guān)系與四川、福建等地流行的病毒親緣關(guān)系密切，同源性較高，提示云南省江城縣羊群中流行的ENV-2 可能與四川、福建省的流行毒株相關(guān)。隨著我國(guó)交通運(yùn)輸系統(tǒng)的完善，跨省調(diào)運(yùn)動(dòng)物便利性提高，導(dǎo)致存在一定的ENT 流行風(fēng)險(xiǎn)，因此云南省需要加強(qiáng)ENT 監(jiān)測(cè)，了解其在云南省山羊群中的流行情況及其病原遺傳變化特征。

ENTV-2env基因編碼的蛋白具有重要的生理功能，其與山羊的鼻道篩骨上皮細(xì)胞癌變密切相關(guān)，可能是一種致瘤基因[23]。本研究對(duì)江城縣山羊中檢測(cè)到的ENTV-2 env 蛋白190 個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，保守位點(diǎn)186 位和204 均發(fā)生“G →E”的氨基酸突變，由中性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，這可能會(huì)導(dǎo)致蛋白表面電荷發(fā)生改變，至于是否會(huì)影響病毒的一些生物學(xué)功能，還有待進(jìn)一步研究。這2 個(gè)保守位點(diǎn)的氨基酸突變，可能是江城縣ENTV-2 毒株特有的分子特征，這為進(jìn)一步對(duì)該地區(qū)ENTV-2 流行毒株進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。