禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒山東SD2101株的分離鑒定及全基因組序列和致病性分析

桑 淼，蓋小君，劉玲，尹明榮，張傳強，李玉燕，郭龍宗，王一新

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東煙臺 264003；3.昌邑市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東昌邑 261300；4.山東益生種畜禽股份有限公司，山東煙臺 265509）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）是一種致瘤性反轉(zhuǎn)錄病毒，可感染雞、鴨、火雞等禽類，引起以網(wǎng)狀細胞增生以及淋巴組織和其他組織慢性腫瘤為主要特征的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（reticuloendotheliosis，RE）。REV 不僅可以誘發(fā)腫瘤，還可以造成感染禽生長遲緩和嚴重的免疫抑制，從而繼發(fā)其他病原感染，導致禽群淘汰率和死亡率升高，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[1]。該病既可以通過水平接觸傳播，也可以通過種源垂直傳播[2]。此外，使用污染了REV 的禽用弱毒疫苗也是該病的重要傳播方式之一[3-5]。

REV 的前病毒基因組序列全長8.0～9.0 kb，包含gag、pol和env3 個基因以及兩端完全一致的長末端非編碼序列（long terminal repeat，LTR）。1957 年，第1株REV T株從1 只患有內(nèi)臟淋巴瘤的火雞中被分離出來。在我國，何宏虎等[6]1986年首次分離出1株REV-C45株。之后，山東、江蘇等地也多次分離到REV[7-8]。近年來，我國雞群中的REV 血清抗體陽性率逐漸增高，特別是在地方品系雞中尤為明顯[9]。流行病學調(diào)查研究[10-12]顯示，REV 與其他免疫抑制病毒，如馬立克氏病毒（Marek′s disease virus，MDV）、禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）以及雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）混合感染越來越普遍，嚴重威脅家禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

盡管已有文獻[13-16]報道在我國不同地區(qū)、不同類型的雞群中分離到REV，但對分離株致病性的研究相對較少。2021 年，本課題組在山東省某疑似發(fā)病白羽肉種雞群中分離到1株REV野毒株，并將其命名為SD2101株，隨后對病毒全基因組序列進行了測序和遺傳進化分析，并通過動物試驗研究了其致病性。

1 材料方法

1.1 樣品來源

山東省某父母代白羽肉種雞場雞群在100 日齡左右出現(xiàn)生長遲緩、精神萎靡現(xiàn)象，但死亡率較低，剖檢未發(fā)現(xiàn)肝臟和脾臟等部位出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。血清學檢測顯示，該雞群REV 抗體陽性率為36.40%，而J 亞群ALV、AB 亞群ALV 等免疫抑制性病原抗體檢測結(jié)果均為陰性，初步懷疑該雞群發(fā)生REV 感染。無菌采集疑似感染雞抗凝血，1 200 r/min離心5 min后，取血漿凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒、DNA 片段純化回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒，均購自北京諾貝萊生物科技有限公司；REV 特異性單克隆抗體11B118，由山東農(nóng)業(yè)大學崔治中教授惠贈[17]；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗鼠IgG 抗體，購自Sigma公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD-18T 載體，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病毒分離鑒定

將DF-1 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞鋪滿匯合至80%左右時，每孔接種150 μL 疑似感染雞血漿，37 ℃吸附2 h 后，換為含2%胎牛血清的DMEM 細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d 后盲傳。傳代時預先在細胞培養(yǎng)板中放置無菌細胞爬片，7 d 后收集細胞爬片并用預冷的丙酮-乙醇固定液（V:V=3:2）固定；將REV特異性單克隆抗體11B118 加到細胞爬片上，置于37 ℃溫箱中作用45 min；棄去單抗后用PBS 洗滌3 次，然后加入100 μL FITC 標記的羊抗鼠IgG 抗體，置于37 ℃溫箱中作用45 min；棄去單抗后用PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下觀察。為排除所分離毒株可能含有其他病毒污染，通過PCR 或者RT-PCR，對ALV、MDV、禽呼腸孤病毒（avian reovirus，REO）和禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）進行檢測。所用引物序列如表1 所示。

1.4 分離毒株全基因組克隆測序

根據(jù)GenBank 下載的REV 參考株序列合成6對引物，通過PCR 分段擴增REV 全基因組，所用引物序列見表1。使用DNA 提取試劑盒提取感染了REV 的DF-1 基因組DNA，進行PCR 擴增。擴增體系：10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，rTaqDNA聚合酶0.5μL，ddH2O 14.0 μL，總體積為25.0 μL。PCR擴增條件：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃1 min，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，共30個循環(huán)；復延伸72 ℃ 10 min。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后與pMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 本研究所用引物序列信息

1.5 分離毒株前病毒基因組拼接和序列分析

從GenBank 下載33株國內(nèi)外REV 毒株全基因組序列，與本研究所分離的SD2101 毒株全基因組序列、LTR 序列和env基因進行比對。利用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method），對REV 全基因和分段基因進行系統(tǒng)進化樹分析。同時使用DNAstar 軟件MegAIign 程序中的clustal W 算法，計算序列同源性。本研究所選用REV 參考毒株信息見表2。

表2 本研究所選用REV 參考毒株信息

1.6 SD2101株致病性試驗

將50 只1 日齡 SPF 雛雞隨機分為2 組，每組 25 只，分別標記為攻毒組和對照組。其中：攻毒組的25 只SPF 雛雞，于1 日齡采用腹腔注射接種REV SD2101株，每只雞接種1 000 TCID50；對照組的雛雞，接種相同體積的DMEM 培養(yǎng)液。接種后1～6 周內(nèi)，每周測定雞的體質(zhì)量，并分別于接種后第3、4、5 周，每組隨機挑選5 只進行剖殺，計算免疫器官（脾臟、法氏囊、胸腺）指數(shù)。免疫器官指數(shù)=器官質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。為分析REV 對雞體液免疫的抑制作用，所有雞在接種后第1 周，經(jīng)頸部皮下免疫NDV 滅活疫苗和AIV-H9 滅活疫苗，并分別于第3、4、5 周采集雞血清，通過血凝-血凝抑制試驗測定NDV 和AIV-H9 的抗體滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與鑒定

采集疑似患病雞抗凝血，分離血漿并接種于DF-1 細胞；盲傳1 代后，使用REV 特異性單抗11B118 進行IFA 檢測。結(jié)果顯示，試驗組的DF-1 細胞漿呈現(xiàn)綠色陽性熒光染色（圖1-A），證實在患病雞中分離到1株REV，將其命名為SD2101，而對照組DF-1 細胞漿中未見綠色熒光（圖1-B）。PCR 及RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，樣品中不含ALV、MDV、REO 及FAdV 等其他病毒。

2.2 SD2101株全基因組序列測定與拼接

以感染SD2101 毒株的DF-1 細胞基因組DNA為模板，使用6 對引物進行病毒基因組擴增，并將目的片段進行克隆、測序，使用DNAstar 軟件對測序結(jié)果進行拼接，獲得了SD2101株的前病毒全基因組核苷酸序列。SD2101 毒株前病毒全基因序列全長8 284 bp，具有典型的復制完全型逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)，包含gag、pol、env3 個主要基因，兩端為完全一致的LTR 序列，基因組序列中不包含腫瘤基因。其中：gag基因位于934～2 433（1 500 bp），pol基因位 于2 434～6 015（3 582 bp），env基因位于5 952～7 712（1 761 bp）。兩端長末端重復序列LTR 長度為543 bp，分別位于基因組的1～543及7 742～8 284；LTR 由U3、R、U5 三部分組成，長度分別為363 bp（1～363、7 742～8 104）、78 bp（364～441、8 105～8 182）、102 bp（442～543、8 183～8 284）。該毒株序列已上傳GenBank，登錄號為OM864267。

2.3 SD2101株序列變異與進化分析

使用DNAstar 軟件，對SD2101株前病毒全基因組序列與33株REV 參考株的全基因組核苷酸序列進行同源性比對。結(jié)果顯示：SD2101 全基因組與其他參考株序列同源性為95.4%～99.6%，與國內(nèi)分離株HA1101、HLJR0901，以及我國臺灣地區(qū)分離株3337-05、3410-06 同源性最高（99.6%），但與GD1210（95.5%）和SNV（95.4%）同源性相對較低?；谌蚪M序列的遺傳進化規(guī)律與同源性關(guān)系基本一致，所有REV 毒株被劃分為兩個分支，SD2101株處于第一個大的遺傳進化分支上，而IBDV 弱毒疫苗污染株IBD-C1605、美國鴨源分離株SNV、我國雞源分離株GD1210 和SDAUR-S1 處于另一個進化分支上（圖2）。

編碼區(qū)核苷酸序列同源性分析顯示：不同REV 毒株的gag、pol和env3 個編碼序列較為保守，均未出現(xiàn)較大變異。其中，SD2101株gag基因核苷酸序列與參考株同源性為96.5%～99.5%，pol基因核苷酸序列與參考株同源性為96.4%～99.7%，與REV 誘導宿主產(chǎn)生中和抗體密切相關(guān)的env基因也較為保守，核苷酸序列與參考株同源性為95.8%～99.7%。基于env基因的遺傳進化樹與基于全基因組序列的進化樹關(guān)系基本一致，HB2101 毒株與大部分毒株處于一個進化支，而LN1201、IBD-C1605、SNV、GD1210 和SDAUR-S1 處于單獨進化分支（圖3）。

LTR 區(qū)域核苷酸序列同源性分析顯示：SD2101株LTR 與參考株同源性為87.1%～99.4%。在LTR 序列中，U3 區(qū)變異程度最大，而R 區(qū)和U5 區(qū)高度保守。SD2101株的U3 區(qū)與不同參考株的同源性為82.9%～99.4%，與SNV株、SDAUR-S1株和LN1201株等同源性較低，而與HA1101、HLJR0901 和SY1209 等國內(nèi)分離株的同源性較高。根據(jù)LTR 構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，SD2101株與大部分國內(nèi)分離株處于同一進化支，而SNV株、SDAUR-S1株和LN1201株等處于獨立進化支（圖4）。

2.4 SD2101株致病性試驗

將SD2101 腹腔注射接種1 日齡SPF 雞。在整個試驗周期中，感染雞采食均正常，未出現(xiàn)死亡，部分感染雞羽毛蓬松、精神不佳。每周稱量雞的體質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接種后2～6 周內(nèi)，感染組生長緩慢，與對照組相比差異顯著（P＜0.05，圖5-A）。免疫器官指數(shù)計算結(jié)果（圖5-B）顯示，在這3 個時間點，感染組脾臟均出現(xiàn)腫大（差異不明顯），而法氏囊和胸腺均出現(xiàn)不同程度的萎縮（P＜0.05，圖5-C、D）。NDV 和AIV-H9 的抗體滴度檢測結(jié)果（圖5-E、F）顯示，在疫苗免疫后的2～4 周，REV 感染均可顯著降低NDV 和AIV-H9 的抗體滴度（P＜0.05），且REV 感染對NDV 滴度的影響大于對AIV-H9 的影響。

3 討論

REV 不僅可以誘發(fā)禽的腫瘤性疾病，而且可以導致禽免疫抑制，降低其他疫病的疫苗免疫效果[1]。血清流行病學調(diào)查結(jié)果[9]顯示，近年來我國各地REV 感染日益嚴重，在地方品系雞群中陽性率高達80%以上。然而，目前關(guān)于REV 分離鑒定和基因組分析的報道仍然有限，全國范圍內(nèi)的流行病學數(shù)據(jù)相對匱乏[13-16]。這可能與人們將目光重點集中于ALV、MDV 等免疫抑制性疾病有關(guān)，在一定程度上忽視了對REV 的鑒定。本研究從出現(xiàn)生長遲緩和免疫抑制的父母代肉種雞場分離鑒定到1株REV，提示有必要提高對于REV 誘發(fā)疾病的重視程度。

對本研究中分離到的SD2101株全基因組序列進行了測序，并將其與GenBank 上下載的參考株序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD2101株全基因組序列與2011 年江蘇省某雞群分離到的HA1101株同源性最高，而與美國經(jīng)典株SNV 同源性相對較低。基于全基因組的遺傳進化樹分析與同源性比對結(jié)果基本一致，即SD2101 與大部分國內(nèi)分離株處于同一進化支，而美國經(jīng)典株SNV、廣東雞群分離株GD1210 和IBDV 弱毒疫苗污染株C1605 處于另一單獨進化分支，表明REV 分離株遺傳進化關(guān)系與地域和分離時間關(guān)系不大。但總體上，不同REV毒株之間的差異性不大。事實上，即使與REV 誘導宿主產(chǎn)生中和抗體密切相關(guān)的env基因也較為保守，這與同為反轉(zhuǎn)錄病毒的ALV 差別較大。相對來講，LTR 區(qū)特別是U3 區(qū)是REV 差異最大，也是最容易發(fā)生變異的區(qū)域。LTR 區(qū)域在REV 基因組中發(fā)揮啟動子功能。該區(qū)域的插入或突變對于病毒的致病性具有一定影響[15]。本研究中，SD2101株的LTR 區(qū)域與經(jīng)典的REV-A株和最近分離的國內(nèi)雞源BJ1503株最為接近，這可能是不同REV 毒株之間發(fā)生基因重組的結(jié)果。

為了解SD2101株的致病性，選取了1 日齡SPF 雛雞，通過腹腔注射方式接種病毒，并對體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)和對疫苗免疫應答等幾個指標進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)REV SD2101株造成了1 日齡SPF 雞發(fā)育遲緩和免疫器官發(fā)育異常，特別是胸腺和法氏囊出現(xiàn)了明顯萎縮，這與臨床上觀察到的自然感染雞群癥狀基本一致。此外，SD2101株感染還可以顯著抑制雞群對NDV 和AIV-H9 滅活疫苗免疫后的免疫反應，并且對NDV 的抑制作用更加明顯。然而，在剖檢過程中，并未發(fā)現(xiàn)感染雞群明顯的病理變化和腫瘤發(fā)生，這可能是與試驗周期較短有關(guān)，一般認為REV 腫瘤的誘發(fā)需要15 周以上的時間。

總體上，本研究完善了我國REV 的流行病學資料，提示應重視對該病的檢測和防控，特別是控制其早期感染和垂直傳播，否則不僅會影響雞群生產(chǎn)性能，而且其誘發(fā)的免疫抑制還會對其他重大動物疫病防控產(chǎn)生潛在威脅。