3株禽副黏病毒4型國(guó)內(nèi)分離株的基因組序列及生物學(xué)特性分析

李 崢，舒波，彭程，于曉慧，李金平，侯廣宇，蔣文明，王靜靜，王桂軍，劉華雷

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230000；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江西南昌 330000）

目前禽副黏病毒（avian paramyxovirus，APMV）有21 個(gè)種，分別為APMV-1—APMV-21。國(guó)際病毒分類委員會(huì)（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）于2019 年分類報(bào)告中設(shè)立禽腮腺炎病毒亞科，并基于RNA 依賴的RNA 多聚酶（RdRp）將過(guò)去歸為禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）的1～19型病毒進(jìn)行了重新分類，其中1、9、12、13、16～19型歸為正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），2、5～8、10、11、14、15型歸為偏禽腮腺炎病毒屬（Metaavulavirus），3、4型歸為副禽腮腺炎病毒屬（Paraavulavirus）。2019 和2020 年又分別確立了2 種新的禽類副黏病毒——偏禽腮腺炎病毒20型和正禽腮腺炎病毒21型。APMV 是一種有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒，可感染世界上多數(shù)野生及家養(yǎng)禽類。APMV-4 屬于副禽腮腺炎病毒屬，在電鏡下，負(fù)染的病毒顆粒一般呈圓形，表面有致密的纖突，且在病毒內(nèi)部有被囊膜包裹的對(duì)稱螺旋核衣殼[1-4]。1975 年，研究人員首次從我國(guó)香港地區(qū)鴨群中分離到APMV-4[7]，此后從美國(guó)、韓國(guó)、比利時(shí)、南非、俄羅斯等國(guó)家的野鳥和水禽中也陸續(xù)分離到APMV-4[8]。2012 年，我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)APMV-4[5]。APMV-4 主要感染雁形目的野鳥和商品化的水禽（鴨、鵝），通常導(dǎo)致感染禽類出現(xiàn)卡他性氣管炎和間質(zhì)性肺炎[6]。目前，關(guān)于APMV-4 基因組和生物學(xué)特性的研究較少。本研究對(duì)2020 年從我國(guó)野鴨和家鴨中新分離的3株APMV-4 毒株進(jìn)行了基因組測(cè)序和序列分析，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，以期為進(jìn)一步研究我國(guó)APMV-4 的流行病學(xué)分布特點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒來(lái)源

APMV-4/Mallard/Ningxia/224-1/2020、APMV-4/Mallard/Ningxia/Y175-1/2020、APMV-4/Duck/Guangdong/G2191/2020 毒株，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室2020 年在廣東省和寧夏回族自治區(qū)的野鴨和家鴨中分離并保存。

1.2 生物學(xué)特性分析

1.2.1 病毒繁殖 使用1.0 mL 注射器吸取病毒上清液，按照0.2 mL/枚的劑量，經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡的SPF 雞胚，每個(gè)樣品接種5 枚雞胚；接種后，37 ℃繼續(xù)孵育，18 h 后每12 h 照胚1 次，并觀察記錄雞胚死亡情況；收集18 h 以后的死胚及96 h仍存活雞胚，置于4 ℃環(huán)境中4 h，無(wú)菌收取雞胚尿囊液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法[16]測(cè)定病毒血凝（HA）效價(jià)，最終計(jì)算各毒株的HA 效價(jià)平均值。

1.2.2 雞胚半數(shù)感染量（EID50）測(cè)定 將病毒液進(jìn)行10 倍倍比稀釋，取適當(dāng)稀釋度的病毒液接種雞胚，0.1 mL/枚，每個(gè)稀釋度接種5 枚雞胚，96 h 后收獲雞胚尿囊液并測(cè)定HA 效價(jià)，按照Reed-Muench 方法計(jì)算EID50。

1.2.3 病毒致病指數(shù)（ICPI）測(cè)定 取HA 效價(jià)24以上的新鮮病毒液，10 倍稀釋后腦內(nèi)接種1 日齡雛雞，每組10 只雞，每只接種0.05 mL，接種后連續(xù)觀察8 d，每天記錄雞只發(fā)病、死亡情況，并打分，最終計(jì)算病毒的ICPI 值[16]。

1.3 基因組擴(kuò)增與測(cè)序

采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，將提取到的RNA 立即用于RT-PCR擴(kuò)增或置-20 ℃保存。根據(jù)GenBank 中已發(fā)表的APMV-4 全基因組序列，運(yùn)用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)基因組擴(kuò)增引物和RACE 引物，并由青島睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，基因組擴(kuò)增引物序列詳見表1。利用一步法RT-PCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）進(jìn)行基因組擴(kuò)增，按照試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：

表1 APMV-4 全基因組擴(kuò)增引物

50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55～59 ℃30 s，72 ℃ 2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。利用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒（Clontech）擴(kuò)增病毒基因組5′和3′末端。將RT-PCR 產(chǎn)物送青島睿博興科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 遺傳進(jìn)化分析

利用MEGA-X 軟件，對(duì)病毒基因組進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰位相連法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 設(shè)置為1 000 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Lasergene 軟件和MEGA-X 軟件進(jìn)行基因組序列拼接，以及病毒基因組結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒生物學(xué)特性

3株APMV-4分離毒株的HA效價(jià)為（4～5）log2，EID50為（10-7.62～10-7.65）/0.1mL，ICPI值為0～0.23，均為低致病性毒株。3株APMV-4 分離株的生物學(xué)特征見表2。

表2 APMV-4 分離株生物學(xué)特征

2.2 病毒基因組序列

3株APMV-4 分離株的基因組序列分析結(jié)果顯示：3株毒株的基因組長(zhǎng)度均為15 054 nt，基因組結(jié)構(gòu)均為3′-N-P-M-F-HN-L-5′，遵循副黏病毒科的“六堿基原則”；3株毒株的基因組結(jié)構(gòu)與副禽腮腺炎病毒屬的其他成員類似，3′端前導(dǎo)序列長(zhǎng)55 nt，5′端尾隨序列長(zhǎng)度為17 nt，各個(gè)基因間的基因間隔序列（IGS）由9 nt 到42 nt 長(zhǎng)度不等（表3、圖1），3株毒株在N/P和HN/L的IGS有1 nt 的微弱差異（表4）；3株毒株的N、P、M、F、HN和L基因5′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)（untranslated region，UTR）均長(zhǎng)于3′UTR（表3），除N基因外，其余5 個(gè)基因片段的起始序列高度保守（3′-UCCCACCCCUUCC-5′）；3株毒株共有的基因終止序列為3′-AAAUUAAUUUUU-5′，但P、M和L基因中分別存在2、6 和1 nt 的差異（表5）。

表4 基因間序列

表5 基因起始及終止序列

表3 APMV-4 分離株的基因組特征和蛋白質(zhì)特征

3株分離毒株的N 蛋白均編碼457個(gè)氨基酸（amino acid，aa），與目前已知的APMV-4毒株相同，并包含高度保守氨基酸序列322FAPGNFPHMYSYAMG336；3株毒株F 蛋白裂解位點(diǎn)序列均為116DIPQR ↓F121，與大部分APMV-4毒株一致，其F 蛋白具有3 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別位于F1 蛋白第260、455 位以及F2 蛋白的第89 位；分離毒株的F 蛋白有2 個(gè)七肽重復(fù)區(qū)（heptad repeat region，HR），與我國(guó)香港、韓國(guó)分離株相比，僅在F 蛋白頭部非關(guān)鍵位點(diǎn)存在11 處氨基酸差異，而HRa 和HRb 區(qū)域均未出現(xiàn)變異位點(diǎn)；3株毒株的HN 蛋白具有5 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，部分毒株HN 蛋白的第57、103、124、153、262、366、424位氨基酸存在變異（表6），但HN 蛋白唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)（229NRKSCS234）均未發(fā)生變異。

表6 F 蛋白和HN 蛋白氨基酸差異對(duì)比

2.3 病毒基因組核苷酸同源性

選取APMV-1—APMV-21 代表株各1株（表7），與本研究中的3株APMV-4 分離株進(jìn)行基因組核苷酸序列同源性分析。結(jié)果顯示：3株分離株與APMV-4 代表株同源性最高（97.2%～97.5%），與APMV-11同源性最低（37.1%），與其余APMV 代表毒株的核苷酸同源性為38.1%～47.3%（圖2）。

2.4 基因組遺傳進(jìn)化

病毒基因組遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖3）顯示，3株APMV-4 分離毒株屬于副禽腮腺炎病毒屬，與我國(guó)香港、韓國(guó)分離株高度同源。

3 討論

自1975 年首次在我國(guó)香港地區(qū)發(fā)現(xiàn)APMV-4以來(lái)，在雁形目的野生鳥類和家養(yǎng)的鴨、鵝中也分離到多株該型毒株。APMV-4 雖然經(jīng)常感染禽類，但其致病力不強(qiáng)[11]。蛋雞感染APMV-4 后僅表現(xiàn)為產(chǎn)白殼蛋[11]，雞人工感染后出現(xiàn)輕度的卡他性氣管炎或腸淋巴組織增生等癥狀，在人工感染雛雞的腸道和胰腺中可檢測(cè)到病毒[11]。部分研究[12]結(jié)果證明，APMV-4 感染小鼠后，會(huì)廣泛分布于肺臟與鼻甲，但通常不導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病癥狀。與其他型APMV 相比，APMV-4 在雞體內(nèi)復(fù)制力較差，但可在人工感染鴨的氣管和肺中有效復(fù)制，說(shuō)明APMV-4 在鴨體內(nèi)的復(fù)制力較強(qiáng)[12]。本研究中的3株APMV-4 毒株分離自野鴨和家鴨，其在雞胚中的復(fù)制力較差，且對(duì)雛雞表現(xiàn)為低致病力（ICPI為0～0.23），其生物學(xué)特性與大部分APMV-4 分離株一致[13]。

通常情況下，APMV 基因組長(zhǎng)度約15 500 nt，且遵循“六堿基原則”。本研究中的3株APMV-4毒株基因組長(zhǎng)度均為15 054 nt，與其他APMV-4分離株一致[14]。3株APMV-4 分離株的3′端前導(dǎo)序列長(zhǎng)度為55 nt，與大多數(shù)APMV 毒株一致。禽副黏病毒5′端尾隨序列長(zhǎng)度一般為25～60 nt[15]，而APMV-4 尾隨序列僅為17 nt，是APMV 成員中最短的。分析結(jié)果顯示，APMV-4 毒株3′端前導(dǎo)序列與5′端尾隨序列呈現(xiàn)70.3%的互補(bǔ)配對(duì)，且基因組3′端序列具有保守性。除此之外，APMV-4的基因啟動(dòng)序列（3′-UCCCACCCCUUCC-5′）與基因終止序列（3′-AAAUUAAUUUUU-5′）也高度保守，可有效區(qū)分基因組內(nèi)各基因片段。APMV-4 的基因間隔序列與腮腺炎病毒、麻疹病毒和亨尼帕病毒相似[15]。APMV-4 的6 個(gè)基因具有六聚體的基因起始序列，且其P基因編輯位點(diǎn)是APMV 中最具特異性的[17]。

副黏病毒F0 蛋白無(wú)活性，需被宿主細(xì)胞蛋白酶切割成F1 和F2 兩部分才具有生物活性，而F1和F2 蛋白依靠F1 蛋白C346 和F2 蛋白C80 兩個(gè)半胱氨酸連接[17]。本研究中的3株APMV-4 毒株的F 蛋白裂解位點(diǎn)序列為116DIPQR ↓F121，與新城疫弱毒株裂解位點(diǎn)較為相近[18]。此外，F(xiàn)1 蛋白在第260 位以及第455 位存在兩個(gè)高度保守的糖基化位點(diǎn)，F(xiàn)2 蛋白也存在一個(gè)糖基化位點(diǎn)，位于第89 位，同時(shí)F1 蛋白中還存在2 個(gè)疏水性七肽重復(fù)序列，分別為HRa（142～193）和HRb（469～500）。3株APMV-4 毒株的F 蛋白糖基化位點(diǎn)與我國(guó)香港、韓國(guó)分離株對(duì)比并未發(fā)現(xiàn)突變，且七肽重復(fù)區(qū)均一致。APMV-4 的HN 蛋白是一種 II型整合膜蛋白，在第11、58、141、317 和448 位分別存在5 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)[14]，而這3株毒株的HN 蛋白糖基化位點(diǎn)和229～234 位的唾液酸受體結(jié)合基序（NRKSCS）未發(fā)生變異。本研究系統(tǒng)分析了我國(guó)3株APMV-4 鴨源分離株的生物學(xué)特性和基因組特性，為進(jìn)一步了解APMV-4 和科學(xué)防控APMV-4感染提供了參考數(shù)據(jù)。