豬流行性腹瀉病毒山東SD20BZ01株的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

田似報(bào)，尹明榮，王文文，厲磊，王一新，李陽(yáng)

（1.北京中科基因技術(shù)股份有限公司，北京 102600；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018；3.臨沂市畜牧發(fā)展促進(jìn)中心，山東臨沂 276003；4.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、病毒性腸道傳染病[1]。該病的臨床癥狀主要為腹瀉、脫水和嘔吐，尤其以哺乳仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，10 日齡內(nèi)哺乳仔豬死亡率可高達(dá)90%。該病于1971 年首次在英國(guó)被報(bào)道，我國(guó)最早于1984 年分離到PEDV 毒株[2-3]。此后，由于PEDV 疫苗的廣泛使用，該病得到有效控制。然而，自2010 年以來(lái)，PED在我國(guó)再次大面積暴發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

PEDV 屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈RNA 病毒。由于RNA 聚合酶缺乏修正功能，PEDV 在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生變異的概率相對(duì)較高。研究[7]發(fā)現(xiàn)，2010 年以來(lái)我國(guó)PED 再次流行與變異株的出現(xiàn)有關(guān)，經(jīng)典疫苗株對(duì)其保護(hù)效果減弱，從而造成PEDV 的廣泛傳播?；趯?duì)全基因組序列的遺傳進(jìn)化分析，PEDV 可被分為GI 和GII 兩個(gè)基因型。其中，GI 群是以CV777株為主的經(jīng)典毒株，GII 群為近幾年流行的變異毒株，又可進(jìn)一步被分為GII-a 亞群和GII-b 亞群[8]。因此，了解并掌握不同地區(qū)PEDV 毒株變異情況，對(duì)于PED 的針對(duì)性防控具有重要意義。

本試驗(yàn)采用細(xì)胞接種方法，從2020 年山東省濱州市某豬場(chǎng)的PEDV 陽(yáng)性樣品中成功分離到1株P(guān)EDV 毒株，并將其命名為SD20BZ01株。隨后，本研究對(duì)SD20BZ01株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并通過(guò)DNAstar、MEGA 7.0 等軟件，將其與參考毒株序列進(jìn)行同源性比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，以期了解該地區(qū)流行毒株的變異趨勢(shì)，從而為科學(xué)有效防控PED 流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2020 年1 月，山東省濱州市某豬場(chǎng)暴發(fā)腹瀉疫情。發(fā)病豬表現(xiàn)消瘦、精神萎靡，排黃色水樣糞便。剖檢可見(jiàn)小腸腸管膨脹擴(kuò)張，腸壁變?。▓D1-A），腸系膜淋巴結(jié)腫脹出血（圖1-B）。采用膠體金抗原快速檢測(cè)試劑盒（廣州悅洋）進(jìn)行檢測(cè)，初步判定為PEDV 陽(yáng)性。采集發(fā)病豬的腸道組織和糞便樣品，置于-80 ℃凍存。

1.2 主要試劑

高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)自以色列BI 公司；病毒RNA 提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PrimeScript ? One Step RT-PCR Kit、pMD18-T載體連接試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒，購(gòu)自北京諾貝萊生物科技有限公司；Trans 5 000 DNA Marker，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；鼠抗PEDV N 蛋白多克隆抗體，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫與食品檢驗(yàn)研究室制備、保存。

1.3 PEDV 分離與鑒定

將發(fā)病豬腸道組織和腸內(nèi)容物研磨，用0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌，接種至單層生長(zhǎng)的Vero E6細(xì)胞，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加20 μg/mL 的胰蛋白酶，置于含有5% CO2的37 ℃溫箱孵育2 h。孵育結(jié)束后更換新鮮的DMEM 培養(yǎng)基（含20 μg/mL 胰酶），繼續(xù)置于溫箱培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變。若72 h 后仍未出現(xiàn)病變，則繼續(xù)盲傳細(xì)胞。待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞樣品反復(fù)凍融3次后，1 500×g離心15 min，收集上清作為病毒液置于-80 ℃保存。

1.4 間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunoinfluscent assay，IFA）

將Vero E6 細(xì)胞傳代，細(xì)胞長(zhǎng)滿后加入PEDV毒株。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，使用PBS 輕柔清洗細(xì)胞板2 遍，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3 遍，以鼠抗PEDV N 蛋白多克隆抗體為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。隨后，用PBS 清洗3 遍，加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠lgG 抗體，37 ℃孵育2 h；最后，經(jīng)PBS 清洗3 遍，在熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 PEDV 全基因組序列測(cè)定

提取病毒RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑制備cDNA。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，使用15 對(duì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。隨后，將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收，將純化產(chǎn)物連接pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，并將陽(yáng)性菌液送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 SD20BZ01株遺傳進(jìn)化分析

從GeneBank 下載29株國(guó)內(nèi)外具有代表性的PEDV 毒株全基因組序列（表1），與本研究所分離的SD20BZ01株全基因組序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）對(duì)PEDV 全基因序列和S基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析，同時(shí)使用DNAstar 軟件MegAIign 程序中的Clustal W 算法對(duì)序列同源性的進(jìn)行計(jì)算。

表1 本研究所選用PEDV 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定

將病料研磨過(guò)濾，接種Vero E6 細(xì)胞后傳代培養(yǎng)，在第三代逐漸出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮變圓、聚集成團(tuán)、形成合胞體；隨著感染時(shí)間增加，細(xì)胞病變面積變大，并且出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，形成空泡（圖2-A、B）。將病毒重新接種Vero E6 細(xì)胞，感染36 h 后，以鼠抗PEDV N 蛋白多克隆抗體為一抗，通過(guò)IFA 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖2-C、D）顯示，被感染細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯CPE 和熒光信號(hào)，證實(shí)成功分離到1株P(guān)EDV，將其命名為SD20BZ01株。

2.2 SD20BZ01株基因組結(jié)構(gòu)分析

參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道，合成15 對(duì)特異性引物，對(duì)SD20BZ01株基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出符合預(yù)期的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)拼接后獲得SD20BZ01株全基因組序列。PEDV SD20BZ01株全基因組序列長(zhǎng)度為28 038 bp，病毒基因組結(jié)構(gòu)為5′UTR-ORF1a/ORF1b-S-ORF3-E-MN-3′UTR。對(duì)PEDV 不同毒株編碼區(qū)所包含的氨基酸數(shù)目進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，SD20BZ01株的M、N、E基因較為保守，序列大小與參考株基本一致（表2）。

表2 PEDV SD20BZ01株各基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3 SD20BZ01株全基因組同源性與遺傳進(jìn)化分析

SD20BZ01株全基因組序列與其他29株參考毒株全基因組序列的核苷酸同源性為96.4%～98.8%，與2014 年分離自德國(guó)的L00721-GER-2014 毒株同源性最高，為98.8%，與1998 年分離自韓國(guó)的SM98-South Korea毒株同源性最低，為96.4%。SD20BZ01株與我國(guó)2010 年以來(lái)流行的GII-b 亞群變異株序列同源性為97.8%～98.7%，與CV777、DR13、SM98、SD-M 等經(jīng)典毒株同源性為95.4%～96.6%。利用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析其遺傳進(jìn)化規(guī)律。分析結(jié)果顯示，SD20BZ01 與GII-b 亞群CH-SCZY44-2017、ZL29等毒株的進(jìn)化距離較近，而與GI 群的經(jīng)典毒株進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，該結(jié)果與同源性分析結(jié)果基本一致（圖3）。因此，SD20BZ01株屬于近年來(lái)流行的GII-b亞群變異型毒株。

2.4 SD20BZ01株S 基因同源性與遺傳進(jìn)化分析

SD20BZ01株S基因全長(zhǎng)4161bp，編碼1386 個(gè)氨基酸。與疫苗株CV777 相比，S基因存在16 處堿基插入和10 處堿基缺失，同時(shí)伴有大量堿基突變。缺失位點(diǎn)具體為，S基因第163～164 位（CV777）插 入TTG，第173～174 位插 入GGGTGTTAA，第193～194位插入G，第402～403 位插入GAT；插入位點(diǎn)具體為，在第217～218 位（SD20BZ01）缺失A，第479～480 位缺失TGGAAA。其推導(dǎo)的氨基酸在第58～59 位插入QGVN，第139～140 位插入N；第162～163 位缺失DI。同疫苗株CV777 相比，SD20BZ01 在核心表位（core neutralizing epitope，COE）結(jié)構(gòu)域（499～638 位氨基酸區(qū)域）存在氨基酸變異，分別 是A517S、L521S、S523G、V527L、T594S、A605E、G594S、A705D、L612F、I635V。運(yùn) 用DNAstar 軟件對(duì)SD20BZ01株S基因的抗原指數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SD20BZ01株S 蛋白和CV777株S蛋白抗原性基本一致，差別主要集中在20～100 及300～350 氨基酸位置。

SD20BZ01株S基因與其余29株P(guān)EDV 參考株S基因的核苷酸同源性為92.9%～98.8%，與2016 年分離自美國(guó)的PC177 毒株同源性最高，為98.8%；而與SD-M 毒株同源性最低，為92.9%。SD20BZ01株S基因與我國(guó)2010 年以來(lái)流行的GII-b 亞群變異株核苷酸同源性為96.7%～98.7%，與CV777、DR13、SM98、SD-M 等經(jīng)典毒株同源性為93.9%～94.2%?；赟基因序列的進(jìn)化樹(shù)顯示，SD20BZ01株與我國(guó)近年來(lái)分離的變異株位于同一進(jìn)化枝，與CV777 等經(jīng)典毒株所屬的GI 群存在顯著的分支差異（圖4）。上述結(jié)果表明，SD20BZ01株與近年來(lái)國(guó)內(nèi)外流行的GII-b 亞群PEDV 變異株親緣關(guān)系較近，與早期經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。與經(jīng)典株CV777 相比，SD20BZ01株S基因雖然發(fā)生了一定突變，但與近年來(lái)流行的GII-b 亞群PEDV 變異株序列基本一致。

3 討論

PED的流行給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，疫苗免疫是防控該病的主要方式。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種PEDV 疫苗，例如CV777 減毒或滅活疫苗以及活病毒疫苗83P-5、SM98-1和DR13[10]。在我國(guó)，TGEV 和PEDV 二聯(lián)弱毒苗和滅活苗的使用降低了PEDV 對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的損失。然而，2010 年以來(lái)，PEDV 再次流行，疫苗免疫無(wú)法達(dá)到理想保護(hù)效果[7，11-12]。一般認(rèn)為，PEDV 屬于單股正鏈RNA病毒，其RNA 酶缺乏校正功能，因此RNA 病毒容易發(fā)生變異。此次PEDV 流行株的S基因發(fā)生了變異，引起抗原表位發(fā)生改變，從而導(dǎo)致疫苗保護(hù)效果不佳。因此，掌握各地區(qū)當(dāng)前PEDV 流行毒株變異情況，制備特異性疫苗成為防控PEDV持續(xù)傳播的關(guān)鍵。

為了解山東省PEDV 流行株的分子特征及遺傳進(jìn)化規(guī)律，本研究對(duì)山東省濱州市某豬場(chǎng)進(jìn)行了PEDV 流行株分離鑒定和測(cè)序分析。病毒分離鑒定是疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是動(dòng)物病毒生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)。目前，對(duì)于PEDV 的分離培養(yǎng)，一般認(rèn)為在Vero E6 細(xì)胞或IPEC-J2 細(xì)胞上可成功獲得PEDV 細(xì)胞適應(yīng)株。本研究使用Vero E6 細(xì)胞在病料中分離到一株P(guān)EDV。該毒株可使Vero E6 細(xì)胞產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變，且隨著傳代次數(shù)增多，病變時(shí)間變?cè)?。使用特異性引物進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，可擴(kuò)增出目的條帶，證實(shí)成功分離到PEDV 毒株，將其命名為SD20BZ01。

隨后，本研究通過(guò)RT-PCR 進(jìn)行全基因序列的分段擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。分析結(jié)果顯示，SD20BZ01 與GII-b 亞群變異株同源性最高，且位于進(jìn)化樹(shù)的同一分支上，表明SD20BZ01 為GII-b亞群PEDV。PEDV 為冠狀病毒科冠狀病毒屬、有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約28 kb，編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S、M、E、N 蛋白）、15 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1—NSP15）和ORF3[13]。其中S 蛋白位于病毒衣殼外側(cè)，主要作用是識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞特異性受體，啟動(dòng)病毒感染過(guò)程，其變異程度較高，且與PEDV 的毒力和遺傳關(guān)系密切[14]。一般認(rèn)為，PEDV S 蛋白的499～638 位氨基酸是一個(gè)關(guān)鍵的中和表位，并將其命名為COE 區(qū)。本研究對(duì)SD20BZ01 的S基因序列進(jìn)行了比對(duì)和分析。結(jié)果顯示，與CV777株相比，SD20BZ01 的S蛋白發(fā)生了多處突變、缺失和插入事件，而這些改變與近年來(lái)我國(guó)PEDV 變異株基因序列基本一致，提示GII-b 亞群PEDV 變異規(guī)律逐漸趨于穩(wěn)定[9，12，15-16]。與CV777株相比，SD20BZ01株 在中和抗原表位COE 區(qū)有10 個(gè)氨基酸發(fā)生突變，這些突變可能會(huì)影響免疫原性，從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗，造成PED 暴發(fā)。

綜上所述，本研究分離的SD20BZ01株為PEDV GII-b 亞群毒株，其基因序列與近年來(lái)我國(guó)流行的PEDV 變異株突變情況基本一致。對(duì)其全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)于深入了解山東省PEDV 流行狀況，有針對(duì)性設(shè)計(jì)疫苗，以及科學(xué)防控PED 傳播具有重要意義。