36型人腺病毒E4ORF1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其促進(jìn)前脂肪細(xì)胞3T3-L1對葡萄糖利用的作用初探①

王冰麗，陳 哲，艾柯代姆·阿卜杜克熱木，劉迪暉，趙炳堯，關(guān)亞群

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011）

肥胖癥是一種與生活方式和遺傳因素密切相關(guān)的代謝性疾病，是引起2 型糖尿病、高血壓等疾病的重要因素之一，病原微生物感染所引起的肥胖具有其自身特點(diǎn)[1-2]。其中36 型人腺病毒（human adenovirus type 36，Ad36）感染導(dǎo)致人類及實(shí)驗(yàn)動物肥胖的現(xiàn)象已被許多國內(nèi)外研究證實(shí)[3-4]。Ad36可以通過增加單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表達(dá)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體的肥胖狀態(tài)[5]。雖然Ad36 感染可引起肥胖，但是Ad36 感染的肥胖患者并未出現(xiàn)血糖、血脂等指標(biāo)異常升高的現(xiàn)象，提示Ad36 編碼的部分基因可能對血糖或血脂有一定調(diào)控作用。Ad36 早期基因4 開放讀碼框1（Early region 4 open reading frame 1，E4ORF1）編碼少數(shù)氨基酸的蛋白質(zhì)，Rogers等[6]認(rèn)為，E4ORF1是Ad36基因組中促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)積累及葡萄糖攝取的功能基因[7-8]。本研究擬通過構(gòu)建Ad36 E4ORF1 的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-E4ORF1，探究E4ORF1 在前脂肪細(xì)胞3T3-L1 中對糖代謝的調(diào)節(jié)作用，為糖尿病治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；人36 型人腺病毒病毒懸液購自美國ATCC 公司；pcDNA3.1(-)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI購自美國Thermo 公司；T4 連接酶購自美國NEB 公司；2×Taq Mix、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物；高糖培養(yǎng)基(DMEM)購自以色列BI 公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司；EZ Trans II 轉(zhuǎn)染試劑購自上海李記生物公司；TRIzol RNA 提取試劑購自美國Invitrogen 公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara 公司；SYBR Green Real time PCR 試劑盒購自德國QIAGEN 公司；GYS1、FLAG 標(biāo)簽抗體購自博士德公司；HSP90 抗體購自Proteintech 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體購自中杉金橋公司；4%多聚甲醛、ECL發(fā)光液購自Biosharp 公司；葡萄糖檢測試劑盒、油紅O 染液購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 E4ORF1 基因擴(kuò)增 載體構(gòu)建方法與文獻(xiàn)[9]描述的一致，具體如下：根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中Ad36 的基因組序列及注釋（GQ384080.1）提取出E4ORF1 的基因序列。利用primer5 軟件設(shè)計Ad36 E4ORF1 的上下游引物，并在上游引物5'端插入FLAG（DYKDDDDK 肽）標(biāo)簽序列，在上下游引物中分別加入EcoRI 和BamHI 酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列。E4ORF1 上游引物序列：5'-GAATTCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCTGAATCTCTGTATGCTTTCATA-3'，下游引物序列：5'-CGGGATCCCTAAACCAGGGTGGCTATTCT-3'，擴(kuò)增長度418 bp。待前脂肪細(xì)胞3T3-L1 匯合率達(dá)80%后，更換不含血清的高糖培養(yǎng)基饑餓2 h 后，加入5 MOI（Multiplicity of infection，病毒感染復(fù)數(shù)）的Ad36病毒懸液感染1h，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d后，利用Trizol 法提取Ad36 感染前脂肪細(xì)胞3T3-L1的總RNA，先行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增E4ORF1 編碼序列。50 μLPCR 反應(yīng)體系如下：2×Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，cDNA 模板1 μL，上游引物（10 μmol/L）2 μL，下游引物（10 μmol/L）2 μL。按以下程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果，切取含目的片段的凝膠，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.2.2 pcDNA3.1-E4ORF1的構(gòu)建和鑒定 用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和BamHI 于37℃雙酶切PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與pcDNA3.1(-)空載2 h，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收E4ORF1 基因片段和空載片段，用于連接反應(yīng)。用T4 DNA 連接酶將E4ORF1 基因片段和pcDNA3.1(-)空載片段以1∶3 摩爾比于25℃連接4 h，將連接產(chǎn)物加入到DH5α（感受態(tài)細(xì)胞）中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日從平板中隨機(jī)挑取單克隆菌落，分別接種于5 mL 含氨芐青霉素的LB（細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中，充分混勻，37℃220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取pcDNA3.1-E4ORF1 重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切鑒定，DNA測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2.3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-E4ORF1 質(zhì)粒 將前脂肪細(xì)胞3T3-L1 用含10% 胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫恒濕的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%，棄去培養(yǎng)基，每個3.5 cm 培養(yǎng)皿加入200μL Opti-MEM 培養(yǎng)基。按照EZ Trans II 轉(zhuǎn)染試劑說明書將無內(nèi)毒素質(zhì)粒pcDNA3.1-E4ORF1 和對照空載pcDNA3.1(-)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，12 h 后同時換為新鮮的完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 RNA 提取和RT-qPCR 擴(kuò)增 使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA 濃度及A260/A280。利用Perlprimer 軟件設(shè)計引物并由上海生工合成，序列見表1。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用SYBR Green Real time PCR 試劑盒進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，檢測以下基因mRNA 水平表達(dá)變化。使用(RQ)=2-ΔΔCt計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時熒光定量PCR 引物序列

1.2.5 免疫印跡（Western-Blot）待前脂肪細(xì)胞3T3-L1 匯合達(dá)80%時，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，加入100 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后，用BCA 法對蛋白進(jìn)行定量；使用12%的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）進(jìn)行電泳后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，使用5%的脫脂奶進(jìn)行封閉。將一抗按照Anti-FLAG（1∶5000）、Anti-HSP90（1∶5000）用5%脫脂奶稀釋。4℃搖床上，孵育一抗12 h。然后用5 mL TBST 清洗4次，每次5 min；室溫?fù)u床，孵育二抗1 h，接著用5 mL TBST清洗4次，每次5 min。用ECL（增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液）進(jìn)行顯色，Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2.6 培養(yǎng)基葡萄糖濃度檢測 前脂肪細(xì)胞3T3-L1分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-E4ORF1 和pcDNA3.1(-)質(zhì)粒12 h后換液，開始檢測培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，每隔8 h 測一次葡萄糖濃度直至72 h。取100μL 細(xì)胞培養(yǎng)基于1.5 mL EP 管中，1000 r/min，離心10 min。在96 孔板中分別加入200 μL 的底物溶液R1，空白孔中加入2μL的ddH2O，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入2μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔中加入2 μL 待測培養(yǎng)基上清。震蕩混勻后，37℃孵育3 min，使用酶標(biāo)儀測定340 nm 處吸光度值為A1。每孔中加入50 μL 的己糖激酶溶液R2，震蕩混勻后，37℃孵育5 min，測定340 nm 處吸光度值為A2。ΔA=A2-A1。計算公式為：葡萄糖濃度（mmol/L）=ΔA（待測）-ΔA（空白）/ΔA（標(biāo)準(zhǔn)）-ΔA（空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L）。

1.2.7 油紅O 染色 分別收取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-E4ORF1后第0、1、2、3、4 天的細(xì)胞，用PBS 清洗2 次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄去4%多聚甲醛后用PBS清洗2次，加入油紅O染色液（試劑儲備液與試劑稀釋液按5∶2 比例配制并充分混勻），室溫靜置20 min 后，棄去染液，用PBS 清洗2 次，在萊卡倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-E4ORF1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物電泳可見約418 bp特異性條帶，符合目的基因預(yù)期大?。▓D1A）。將重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI 和BamHI雙酶切鑒定，可在5000 bp 和400 bp 觀察到特異性條帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果完全相符（圖1B），表明E4ORF1 基因序列已插入到pcDNA3.1(-)空載。DNA 測序比對結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的DNA 序列與E4ORF1基因的編碼序列完全一致（圖1C），證明成功構(gòu)建pcDNA3.1-E4ORF1真核表達(dá)載體。

圖1 pcDNA3.1-E4ORF1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

2.2 前脂肪細(xì)胞3T3-L1 中E4ORF1 對其培養(yǎng)基葡萄糖含量的影響與對照組相比，轉(zhuǎn)染組E4ORF1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2及圖2A、2B。前脂肪細(xì)胞3T3-L1中表達(dá)E4ORF13d 后，細(xì)胞培養(yǎng)基的顏色變黃（圖2C）。與對照組相比，E4ORF1 轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度隨培養(yǎng)時間延長下降更快，從第2天開始兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表3、圖2D）。

圖2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞中E4ORF1對其培養(yǎng)基葡萄糖濃度的影響

表2 E4ORF1過表達(dá)效率（±s）

表2 E4ORF1過表達(dá)效率（±s）

組別對照組E4ORF1轉(zhuǎn)染組tP第1天1.00±0.343.06±0.401.3570.673第2天1.00±0.424.83±0.452.3120.041第3 天1.00±0.546.93±0.562.5730.007第4 天1.00±0.459.45±0.544.3610.005

表3 培養(yǎng)基葡萄糖濃度測定（mmol/L，±s）

表3 培養(yǎng)基葡萄糖濃度測定（mmol/L，±s）

時間第0小時第8小時第16小時第24小時第32小時第40小時第48小時第56小時第64小時第72小時對照組22.71±0.3822.27±0.1620.30±0.4320.46±0.3020.63±0.2918.64±1.2719.77±0.5216.32±1.7315.60±0.3415.12±1.98 E4ORF1轉(zhuǎn)染組22.60±0.3622.72±0.5619.02±0.2518.03±0.7415.52±0.8813.54±0.967.03±1.497.47±0.903.88±1.455.14±0.74 t 1.5871.5321.4901.5971.5641.8544.3922.5763.1382.783 P 0.9820.8710.8230.7820.6550.5280.0050.0070.0060.007

2.3 E4ORF1 對HK2 和GYS1 基因表達(dá)的 調(diào)節(jié)作用

RT-qPCR 和Western-Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，E4ORF1轉(zhuǎn)染組從第2天起，HK2的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，在第3、4 天GYS1 的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表4、圖3）。

圖3 E4ORF1對HK2和GYS1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

表4 HK2和GYS1 mRNA表達(dá)水平（±s）

表4 HK2和GYS1 mRNA表達(dá)水平（±s）

mRNA名稱HK2第1天第2天第3天第4天GYS1第1天第2天第3天第4天對照組1.00±0.021.00±0.051.00±0.181.00±0.311.00±0.011.00±0.051.00±0.251.00±0.17 E4ORF1轉(zhuǎn)染組1.29±0.102.19±0.896.53±0.978.41±0.151.56±0.132.28±0.033.29±0.163.59±0.16 t 1.2551.3481.6921.8411.2531.1961.3521.375 P 0.0610.0430.0100.0070.07430.08950.0460.042

2.4 E4ORF1對前脂肪細(xì)胞成脂分化的作用通過油紅O 染色觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，對照組和E4ORF1 轉(zhuǎn)染組第1、2、3、4天，細(xì)胞內(nèi)脂滴并沒有隨培養(yǎng)天數(shù)延長而產(chǎn)生積聚，提示3T3-L1 前脂肪細(xì)胞未向成熟脂肪細(xì)胞分化（圖4）。

圖4 E4ORF1對前脂肪細(xì)胞成脂分化的影響（×200）

2.5 E4ORF1 對前脂肪細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN、ACC 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用RT-qPCR 和Western-Blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，E4ORF1 轉(zhuǎn)染組PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN和ACC 在第1、2、3、4 天的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表5及圖5、圖6）。

圖5 E4ORF1對前脂肪細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN、ACC表達(dá)的影響

圖6 E4ORF1對前脂肪細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN、ACC表達(dá)的影響

表5 前脂肪細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平（±s）

表5 前脂肪細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平（±s）

mRNA名稱PPARγ第1天第2天第3天第4天C/EBPα第1天第2 天第3 天第4 天FABP4第1天第2天第3天第4天FASN第1天第2天第3天第4天ACC第1天第2天第3天第4天對照組1.00±0.021.00±0.041.00±0.071.00±0.651.00±0.031.00±0.041.00±0.231.00±0.451.00±0.031.00±0.051.00±0.071.00±0.071.00±0.031.00±0.041.00±0.031.00±0.051.00±0.011.00±0.021.00±0.031.00±0.05 E4ORF1轉(zhuǎn)染組0.98±0.100.96±0.870.93±0.930.94±0.170.86±0.210.82±0.790.91±0.760.84±0.230.89±0.150.89±0.780.86±0.930.85±0.230.88±0.220.97±0.261.09±0.231.10±0.330.88±0.200.87±0.130.97±0.240.84±0.26 t 1.2351.3411.3721.3631.5321.5681.4061.5271.4211.4151.5841.4931.5431.5521.4221,4251.5471.5111.5331.575 P 0.0560.0630.0690.0670.0650.1010.0540.0770.0570.0590.0520.0530.0600.0540.0730.0760.0610.0590.0580.066

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人們生活方式的改變，肥胖癥已成為一種全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷升高的慢性代謝性疾病[10-11]。其中病原微生物感染是引起肥胖的重要原因之一[12-13]，以Ad36 引起的肥胖最為典型。研究報道，Ad36 的E4 區(qū)基因可讀框1（E4ORF1）通過激活磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信號途徑，上調(diào)遠(yuǎn)端胰島素信號通路，增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）從胞質(zhì)到胞膜的易位，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取，并引起脂肪細(xì)胞分化[14-15]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，在阻斷E4ORF1表達(dá)后，可以消除Ad36 的成脂以及降糖功能。E4ORF1獨(dú)特的降血糖功能可能成為治療2型糖尿病的新思路，而目前對于E4ORF1 調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞中對糖代謝的作用尚不明確。

為探究E4ORF1 在前脂肪細(xì)胞3T3-L1 中對糖代謝及成脂分化的影響，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建E4ORF1 真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究E4ORF1 蛋白的生物功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及思路。本研究在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中過表達(dá)E4ORF1 后發(fā)現(xiàn)，E4ORF1 轉(zhuǎn)染組與對照組相比培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在第2 天后顯著下降（P＜0.01）。培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低，培養(yǎng)基變黃，提示細(xì)胞對葡萄糖的分解能力增強(qiáng)。己糖激酶2（Hexokinase 2，HK2）是糖酵解途徑中的第一個關(guān)鍵酶，其功能是催化葡萄糖磷酸化生成葡糖-6-磷酸，研究發(fā)現(xiàn)HK2 的活性降低可以使細(xì)胞糖原合成減少，線粒體氧化磷酸化減弱，是最終導(dǎo)致胰島素抵抗的原因之一[16-17]。糖原合成起始于糖酵解的中間產(chǎn)物葡糖-6-磷酸，糖原合酶1（GYS1）屬于糖基轉(zhuǎn)移酶，是糖原合成過程中的關(guān)鍵酶。在本研究中，E4ORF1轉(zhuǎn)染組中HK2和GYS1表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.05）。提示在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，E4ORF1可能通過促進(jìn)HK2 和GYS1 的基因表達(dá)，從而參與葡萄糖的吸收并促進(jìn)糖原合成。本研究結(jié)果中E4ORF1 的靶基因HK2 與Thai 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)一致，E4ORF1 定位于細(xì)胞核，并作為轉(zhuǎn)錄因子MYC（原癌基因MYC 的蛋白質(zhì)產(chǎn)物）的輔因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。本研究結(jié)果中HK2作為E4ORF1的靶基因，且兩者表達(dá)水平的一致性和基于腺病毒E4ORF1 基因的高度保守性，推測E4ORF1 可能作為某些轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子參與基因的轉(zhuǎn)錄過程，上調(diào)糖酵解相關(guān)基因HK2 的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)前脂肪細(xì)胞3T3-L1 的糖酵解，降低葡萄糖水平。

細(xì)胞分化過程中涉及各種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)特定基因程序化表達(dá)[19-21]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）是脂肪細(xì)胞分化必需的調(diào)控因子。脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）負(fù)責(zé)游離脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存，其升高與肥胖、胰島素抵抗和動脈粥樣硬化有關(guān)[22]。乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是以乙酰輔酶A 為底物促進(jìn)脂肪酸合成的主要限速酶。乙酰輔酶A 可在的羧化作用下生成丙二酸單酰輔酶A（Malonyl Coenzyme A，MA），ACC作為長鏈脂肪酸合成的二碳單位的供體，可以促進(jìn)甘油三酯的合成。但本研究中未見細(xì)胞成脂分化明顯的形態(tài)學(xué)特征，并在E4ORF1 過表達(dá)后4 d 內(nèi)脂肪細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、FASN、ACC 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均無顯著變化（P＞0.05）。提示E4ORF1 可能對前脂肪細(xì)胞3T3-L1 吸收葡萄糖具有正向調(diào)節(jié)作用，從而參與Ad36 引起的前脂肪細(xì)胞對葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，而并不足以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的成脂分化。雖然Ad36感染能夠引起人和實(shí)驗(yàn)動物肥胖已被證實(shí)，但脂肪細(xì)胞分化是一個多基因共同調(diào)控的過程[23]，Ad36 引起肥胖的效應(yīng)可能是其編碼的多個基因共同作用引起的。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建pcDNA3.1-E4ORF1真核表達(dá)載體，在前脂肪細(xì)胞3T3-L1 中，E4ORF1 可能通過正向調(diào)控HK2 和GYS1 的表達(dá)，利于細(xì)胞對葡萄糖的分解和利用，而不能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化。E4ORF1 對糖代謝調(diào)控的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，并為后續(xù)可能的肽類降糖功能藥物轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。