河南省溫縣鐵棍山藥根腐線蟲種類鑒定

趙偉超 秦朝 張江利 李明軍 楊清香 高錦

摘要 為明確河南省溫縣鐵棍山藥病原線蟲種類，在溫縣鐵棍山藥種植區(qū)采集有明顯癥狀的塊莖進(jìn)行線蟲分離，觀察線蟲的雌、雄成蟲的形態(tài)特征，并擴(kuò)增rDNA的 28S D2-D3序列對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，從山藥塊莖中分離出的根腐線蟲形態(tài)學(xué)特征及測量指標(biāo)與咖啡短體線蟲Pratylenchuscoffeae基本一致，其28S D2-D3序列與P.coffeae相似性達(dá)99.87%～100%。本研究明確了河南省溫縣地區(qū)鐵棍山藥根腐線蟲為咖啡短體線蟲，為山藥線蟲病的鑒別及防控提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 咖啡短體線蟲;鐵棍山藥;病原;鑒定

中圖分類號： S435.39

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021487

Abstract In order to clarify the nematode pathogen species of Dioscorea polystachya root lesion nematode rot disease in Wenxian of Henan province， the tubers with obvious symptoms were collected for isolating nematodes from the planting region of yam in November， 2020. The pathogenic nematodes were identified by observing the traditional morphological characteristics of female and male adults， and molecular biological identification was carried out based on 28S D2-D3 sequence of rDNA. The results showed that the morphological characteristics and measurement indexes of root lesion nematodes isolated from yam tubers were consistent with those of Pratylenchus coffeae， and the 28S D2-D3 sequence was 99.87%-100% identical to that of P.coffeae. This study confirmed for the first time that the root lesion nematode of D.polystachya in Wenxian of Henan province was P.coffeae， and provided a scientific basis for the identification and control of yam nematode diseases.

Key words Pratylenchus coffeae;Dioscorea polystachya;pathogen;identification

鐵棍山藥Dioscorea polystachya ‘Tiegun原產(chǎn)于河南懷區(qū)（溫縣、沁陽、武陟等地），是山藥中的優(yōu)良品種[1-2]，在河南、河北、山東等山藥主產(chǎn)區(qū)廣泛種植，是我國種植面積最大的山藥品種。鐵棍山藥地下塊莖的營養(yǎng)成分和藥用成分含量很高，品質(zhì)極佳，深受廣大消費(fèi)者青睞[3]，市場前景廣闊。

目前，我國發(fā)現(xiàn)的危害山藥的線蟲主要分為兩個屬，分別是根結(jié)線蟲屬M(fèi)eloidogyne和短體線蟲屬Pratylenchus[4]。根結(jié)線蟲主要危害山藥的根系和塊莖，受害植株前期地上部分無明顯癥狀;中后期葉片變小，嚴(yán)重時葉片變黃脫落。在線蟲侵入點(diǎn)周圍凸起，產(chǎn)生如米粒大小的根結(jié)，嚴(yán)重時多個根結(jié)愈合形成疙瘩，塊莖生長點(diǎn)受到損傷，影響其膨大及發(fā)育。短體線蟲也被稱為根腐線蟲（root-rot nematode），初期危害山藥的種薯和幼根，在侵染點(diǎn)附近可形成小的枯斑，嚴(yán)重時聯(lián)合形成黑色復(fù)合病斑，導(dǎo)致根系死亡;后期主要危害山藥塊莖，先形成淺褐色小點(diǎn)，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)榻鼒A形或不規(guī)則形的褐色病斑，受害的塊莖病斑形成大片黑褐色斑塊，引起山藥塊莖的腐爛，嚴(yán)重影響山藥的產(chǎn)量與品質(zhì)。

根腐線蟲病引起的我國山藥損失主要是由穿刺短體線蟲P.penetrans[5]、薯蕷短體線蟲P.dioscoreae[6]、咖啡短體線蟲P.coffeae[7]造成。由于根腐線蟲存在種內(nèi)變異、種間形態(tài)相似等特點(diǎn)，常造成形態(tài)鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確[8-10]，需結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。線蟲的rDNA LSU D2-D3區(qū)作為種間相對穩(wěn)定的序列，已廣泛應(yīng)用于線蟲的種類鑒定[11]。從廣西淮山[12]、瑞昌山藥[13]及山西省窖藏薯蕷[14]塊莖中分離鑒定出寄生病原咖啡短體線蟲至今，未見其他有關(guān)山藥根腐線蟲病的報道。2020年11月我們對溫縣鐵棍山藥種植區(qū)的山藥根腐線蟲病害進(jìn)行了發(fā)病癥狀觀察以及病原鑒定，旨在明確鐵棍山藥根腐線蟲病的病原種類，為根腐線蟲的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病樣：2020年11月在河南溫縣中西部的張寺村、祥云鎮(zhèn)村、韓郭作村的三塊山藥種植地采集具有典型根腐線蟲病癥狀的山藥塊莖，其中每塊種植地取樣各2份，共采集樣本6份，編號為WX-1～WX-6。收獲時，每塊地隨機(jī)選擇5個區(qū)域，每個區(qū)域共50株山藥進(jìn)行調(diào)查，觀察并統(tǒng)計(jì)其根腐線蟲發(fā)病率。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行線蟲分離。

1.2 根腐線蟲病的田間癥狀觀察

將采集的山藥樣本W(wǎng)X-1～WX-6用自來水沖洗后稍微晾干，觀察其塊莖癥狀并拍照（索尼ILCE-7RM3）。C114CD8A-E8C3-4713-A743-D2D54253F741

1.3 根腐線蟲分離及固定

取根腐線蟲病害山藥塊莖用清水洗干凈，切成小塊后，采用改良貝曼漏斗法分離線蟲，將得到的線蟲提取液置于65℃水浴中2 min，后放在室溫自然冷卻。隨后用甲醛-冰醋酸（FA）固定液（40%甲醛10 mL，冰醋酸1 mL，加蒸餾水至100 mL）將線蟲固定[15]。

1.4 根腐線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

在載玻片上加一滴水，將固定好的線蟲用解剖針挑取1～2條置于水中，封蓋蓋玻片后，小心吸取多余的水，貼上標(biāo)簽后用于普通光學(xué)顯微鏡觀察拍照（OLYMPUS BX51），并對蟲體相關(guān)部位進(jìn)行測量和記錄，采用德曼氏公式（De Man）計(jì)算形態(tài)測量值，比對有關(guān)文獻(xiàn)資料鑒定其種類[15-17]。

1.5 根腐線蟲種類的分子鑒定

線蟲DNA的提?。翰≡€蟲DNA的提取方法參照黃金玲等[12]。在顯微鏡下，吸取線蟲1條至具有100 μL去離子水的載玻片上，反復(fù)漂洗3次，而后將線蟲轉(zhuǎn)移至含有16 μL去離子水的1.5 mL離心管中，加入2 μL 10×PCR Buffer，放入液氮中1 min，轉(zhuǎn)入95℃水浴鍋中加熱2 min，反復(fù)凍融3次后，加入1 μL 1 mg/mL的蛋白酶K，置于65℃水浴鍋中1～2 h，95℃條件下保溫10 min，使蛋白酶失活。取出后12 000 r/min離心1 min取上清液用于PCR擴(kuò)增或者置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

特異片段擴(kuò)增：引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物對分別為D2A/D3B和PC28sF/PC28sR。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下：25 μL體系包括DNA提取物2 μL，上下游引物各0.5 μmol/L，0.2 mmol/L dNTPs， 1×PCR Buffer，1.5 mmol/L MgCl2以及0.75 U Taq DNA酶。D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′）/ D3B（5′- TCGGAAGGAACCAGCTACTA -3′）對根腐線蟲核糖體DNA的28S D2-D3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[11]，擴(kuò)增條件為94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，40個循環(huán);72℃ 5 min。選用Bell等[18]設(shè)計(jì)的根腐線蟲特異性引物PC28sF（5′-CCGTGAGGGAAAGTTGAAAA-3′）/PC28sR（5′-GCTCCTAACGGAAACGTTCA-3′）對線蟲基因組DNA的28S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 5 min;94℃ 10 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán);72℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

28S rDNA目的片段測序：PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（TaKaRa 9762）進(jìn)行純化回收后，連接至pMD19-T克隆載體（TaKaRa 6013），再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，得到陽性克隆后，使用TIANGEN DP103試劑盒提取質(zhì)粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將所得目的片段序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對。

系統(tǒng)進(jìn)化分析：測序結(jié)果于GenBank進(jìn)行BLAST相似性分析后，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載同源性較高的相關(guān)根腐線蟲種群的rDNA 28S D2-D3區(qū)序列，使用 MEGA 軟件中的 Clustal W 工具對序列進(jìn)行比對分析[19]，選用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建供試病原線蟲與其他根腐線蟲 rDNA 28S D2-D3區(qū)序列進(jìn)化樹，分析根腐線蟲親緣性，發(fā)育樹中以禾谷孢囊線蟲Heterodera avenae作為屬外種參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵棍山藥根腐線蟲病癥狀

在溫縣鐵棍山藥種植區(qū)，根腐線蟲病在山藥整個生育期均可發(fā)病，一般近收獲期11月中下旬發(fā)病最為嚴(yán)重，且連作地塊較新種植地塊發(fā)病更重。三塊山藥種植地中，祥云鎮(zhèn)村為一年連作（1 200 m2），張寺村（3 333 m2）和韓郭作村（6 667 m2）為首次耕種。經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，三地區(qū)的根腐線蟲發(fā)病率分別為20.4%，6.0%和8.8%。發(fā)病植株地上部表現(xiàn)為部分葉色偏淡，嚴(yán)重時葉片發(fā)黃，植株矮化。地下部分表現(xiàn)為發(fā)病初期根系表面出現(xiàn)黃褐色傷口，并逐漸縊縮為黑褐色斑點(diǎn)，后期受害山藥塊莖部分呈現(xiàn)淺黃色斑點(diǎn)，后蔓延為不規(guī)則形狀的深褐色病斑，且塊莖外表伴有大小不等的瘤狀物，表面有龜裂，塊莖上的病斑從外向里由黃褐色變?yōu)樯詈稚▓D1）。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

對分離自溫縣地區(qū)鐵棍山藥病樣中的線蟲進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)從所有樣本中分離的根腐線蟲形態(tài)特征基本一致，對供試線蟲進(jìn)行純培養(yǎng)，獲得1個純種群。

種群形態(tài)特征：1）雌蟲：加熱殺死的蟲體略彎呈字母C狀或僵直（圖2a），頭架角質(zhì)化，唇區(qū)有環(huán)紋，口針粗短，長度16.42～18.44 μm，口針基部球發(fā)達(dá)呈橢圓形（圖2d， e）。中間食道球?yàn)槁褕A形（圖2b），陰門在蟲體后部，卵巢向前伸展，具有后陰子宮囊（圖2c），尾端鈍圓，尾長為肛門處蟲體直徑的1.24～1.94倍（圖2f， g）。2）雄蟲：體前端與雌蟲特征基本類似，與雌蟲相比，雄蟲體型略短且纖細(xì)一些（圖2n）。唇區(qū)及口針基部球較雌蟲略弱（圖2h， i），蟲體尾部的交合刺細(xì)長，并且略向內(nèi)側(cè)彎曲，尾部較尖（圖2j， k， m）。測量值（表1）與短體線蟲屬中咖啡短體線蟲Pratylenchus coffeae的形態(tài)特征和相關(guān)測量數(shù)據(jù)一致，故從形態(tài)上將其初步鑒定為咖啡短體線蟲。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

對鐵棍山藥病害組織中提取的根腐線蟲的rDNA 28S D2-D3區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增并測序，6份樣本均能擴(kuò)增出大小為781 bp 的片段（圖3a）。經(jīng) BLAST比對分析顯示，6份樣本的根腐線蟲 rDNA 28S D2-D3序列一致（GenBank登錄號分別為MZ188915.1、OL616098.1、OL629163.1、OL629176.1、OL635167.1、OL635166.1），均與咖啡短體線蟲（GenBank登錄號為MT586754.1）的序列相似性最高，相似度為99.87%～100%?；趓DNA 28S D2-D3區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，本研究得到的序列與已知咖啡短體線蟲序列（GenBank登錄號分別為MT586754.1、HQ688681.1和KC857659.1）聚為一個分支，且與其他種的13條序列明顯區(qū)分開（圖4），因此將其認(rèn)定為咖啡短體線蟲。C114CD8A-E8C3-4713-A743-D2D54253F741

利用咖啡短體線蟲特異性引物PC28sF/PC28sR[18]進(jìn)行PCR檢測，6個樣本均能獲得長度為530 bp的特異性條帶（圖3b），進(jìn)一步證明了寄生鐵棍山藥的根腐線蟲為咖啡短體線蟲。

3 討論

根腐線蟲為遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，嚴(yán)重危害植物地下根和塊莖，對作物產(chǎn)生的危害僅次于根結(jié)線蟲和孢囊線蟲[20]。根腐線蟲的種類繁多，形態(tài)多樣，寄主廣泛，國內(nèi)外均有其對山藥危害的報道。在非洲發(fā)現(xiàn)短尾短體線蟲P.brachyurus、假草地短體線蟲P.pseudopratensis和蘇丹短體線蟲P.sudanensis侵染危害山藥[10， 21-22]。在中美洲、加勒比海和太平洋地區(qū)均有咖啡短體線蟲寄生危害山藥的報道[23-25]。我國的山東、河南、河北、廣西、江西、山西和陜西等地發(fā)現(xiàn)穿刺短體線蟲P.penetrans、薯蕷短體線蟲P.dioscoreae和咖啡短體線蟲侵害山藥[4， 12-13]。山藥主要以塊莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖。根腐線蟲可在帶蟲塊莖內(nèi)越冬，次年播種后在塊莖內(nèi)產(chǎn)卵繁殖，并通過土壤及農(nóng)事活動進(jìn)行傳播，造成的危害極大。此外，鐵棍山藥被根腐線蟲寄生，可導(dǎo)致土壤中根腐線蟲的蟲口密度和分布面積加大，為土壤中的病原菌侵入寄主提供了有利條件，在根腐線蟲以及致病菌的共同作用下，使寄主根部及塊莖大面積腐爛，形成更加嚴(yán)重的復(fù)合病害。

利用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法對根腐線蟲種類鑒定是國內(nèi)外研究者常采用的研究方法[12-14]，本研究對河南溫縣鐵棍山藥病害塊莖分離得到的根腐線蟲進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，與報道的根腐線蟲的特征[7]基本一致，僅個別測量數(shù)據(jù)稍有偏差，這可能是由于地域、土壤、氣候等環(huán)境因子以及寄主不同造成的差異。從表1測量結(jié)果來看，咖啡短體線蟲種群的測量值與賀哲等[13]的描述相比，雌蟲的體長及b值均較小，雄蟲的體長稍長及b值偏小，因此僅靠形態(tài)特征很難得出準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。本研究進(jìn)一步采用分子生物學(xué)手段對目標(biāo)根腐線蟲種類進(jìn)行鑒定，線蟲的rDNA 28S D2-D3區(qū)是一個種間相對保守的序列，通過擴(kuò)增6份樣本上根腐線蟲的28S D2-D3序列，獲得長度為781 bp的目的片段，與夏艷輝等[26]采用相同引物擴(kuò)增的咖啡短體線蟲rDNA的28S D2-D3片段大小一致，BLAST比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，該根腐線蟲與咖啡短體線蟲親緣關(guān)系最近。此外，本研究采用咖啡短體線蟲的特異性引物PC28sF/PC28sR對目標(biāo)根腐線蟲DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6份樣本均能擴(kuò)增出大小為530 bp的特異性條帶，再次證明寄生鐵棍山藥的根腐線蟲為咖啡短體線蟲，這與Bell 等[18]的結(jié)果一致。

作為一種頑固的土傳病害，山藥根腐線蟲病不易根治，根腐線蟲的抗逆性和繁殖能力都很強(qiáng)，因此防治比較困難。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對寄生線蟲病的防治仍以化學(xué)藥劑為主，但其環(huán)境污染大、毒性強(qiáng)、對人畜健康存在潛在威脅[27]。生物防治主要是利用線蟲的天敵如真菌和細(xì)菌等進(jìn)行防治，目前仍處于試驗(yàn)階段，應(yīng)用于大田試驗(yàn)的防治效果不太穩(wěn)定，且成本較高。綠色、智能、精準(zhǔn)、高效已成為農(nóng)藥研究與應(yīng)用的方向，篩選和設(shè)計(jì)獲得具有拮抗或阻止線蟲病害特有生理過程的靶標(biāo)抑制劑，進(jìn)而開發(fā)特異性的原創(chuàng)綠色分子靶標(biāo)是研發(fā)山藥根腐線蟲新型農(nóng)藥的關(guān)鍵。本研究明確了溫縣鐵棍山藥的根腐線蟲為咖啡短體線蟲，這將為溫縣地區(qū)鐵棍山藥線蟲病害的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。對咖啡短體線蟲的特有生理過程及靶標(biāo)抑制劑的篩選，將是下一步的研究重點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）C114CD8A-E8C3-4713-A743-D2D54253F741