沙門菌sRNA GcvB及伴侶蛋白Hfq對靶基因stm4351的調控作用

張家莉, 楊 陽, 潘 永, 段世宇, 令狐遠鳳, 楊 琦,3

(1.貴州大學動物科學學院；2.貴州大學動物疫病研究所；3.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025)

沙門菌(Salmonella)是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陰性菌，具有極強的感染性和致病力，能夠引起人和動物傷寒、腹瀉甚至全身性感染等疾病[1].當前，其被公認為是世界上最重要的人畜共患病原菌之一.2017年全球出現(xiàn)1 430萬例人類感染沙門菌的病例，其中13.59萬人死亡[2].

ABC轉運系統(tǒng)(ATP-binding cassette transporter)是細菌生命活動中至關重要的一環(huán)，主要影響細菌對氨基酸的吸收，其通常具有至少一種周質溶質結合蛋白，蛋白經(jīng)外膜孔擴散，通過結合、水解ATP而獲得能量并將多種底物分子如氨基酸類、多肽類、無機離子、金屬離子、糖類轉出(入)細胞，從而對細菌的生存、致病性等產(chǎn)生重要影響[3-5].沙門菌中，stm4351長741 bp，編碼精氨酸ABC轉運蛋白底物結合蛋白，其受長為200 nt的反式編碼調控 sRNA GcvB調控[6-7].以stm4351的mRNA起始密碼子為原點，GcvB可能與其-30～-22的區(qū)域(CACAACAUC)進行配對結合[8].該sRNA來自于靶基因不相鄰基因區(qū)間，與靶基因具有較低的互補性.因此，其具有較強的調節(jié)能力,能調控沙門菌中約1%的mRNA，對氨基酸轉運和代謝的多個靶標的表達具有負調節(jié)作用[9-10].反式編碼調控sRNA大多需要伴侶蛋白Hfq共同作用，而GcvB是革蘭氏陰性細菌中與Hfq相關性最高的sRNA之一.

有關GcvB與伴侶蛋白Hfq對靶基因stm4351的具體調控方式還未明確.本試驗成功構建了stm4351的啟動子與lacZ基因的融合基因，lacZ能與stm4351共用起始密碼子(ATG)進行翻譯并表達出β-半乳糖苷酶(LacZ)，此時lacZ的表達量可視為stm4351的表達量.通過P22噬菌體轉導試驗將GcvB及Hfq單缺失和雙缺失菌株轉入Δstm4351∷lacZ中，以Δstm4351∷lacZ作為對照，利用LacZ活性和stm4351相對轉錄量差異評價GcvB、Hfq對stm4351的調控作用，為探究sRNA對沙門菌的調控機理及制定沙門菌的防控措施奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)標準株LT2、7455菌株(含有質粒pKD46，pKD46是λ red同源重組質粒，攜帶氨芐抗性)、鼠傷寒沙門菌hfq基因缺失株(基因型Δhfq∷tetRA)、鼠傷寒沙門菌gcvB基因缺失株(基因型ΔgcvB∷cat)[11]、鼠傷寒沙門菌hfq和gcvB基因雙缺失菌株(基因型Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat)為本實驗室構建.

P22噬菌體、質粒pCP21(含有FLP重組酶，能識別FRT位點)、pCE40(攜帶FRT位點與lacZ基因，但無lacZ啟動子)、pKD13(攜帶FRT位點，具卡那霉素抗性)均由法國國家科學研究中心分子遺傳學Bossi實驗室惠贈.PCR產(chǎn)物純化試劑盒和RNA提取試劑TRIzol均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；試劑均為分析純.

根據(jù)NCBI提供的基因序列設計引物(表1)，引物送至上海生物工程有限公司合成.

表1 試驗所用引物1)Table 1 Primers used in the experiment

1.2 構建單缺失菌株Δstm4351∷lacZ

參照文獻[12]，以質粒pKD13作為模板，利用引物P1、P2進行PCR擴增.擴增體系：10 μL pKD13，8 μL buffer，57 μL ddH2O，上、下游引物各1 μL，2 μL dNTPs Mix(2.5 mmol·L-1),1 μL Taq 酶和Pfu 酶(3∶1).擴增程序：95 ℃變性10 s、53～60 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，30個循環(huán).將PCR產(chǎn)物純化后保存于-80 ℃.

將7455菌株培養(yǎng)至D600 nm=0.5～0.7，7 500 r·min-1離心6.5 min，用甘油洗凈.將洗凈的菌液與目的片段混勻，倒入電轉杯中進行電轉化(t=5.9 s、U=2.5 V)，電穿孔后迅速用1 mL復蘇液復蘇，37 ℃孵育1 h，抽取100 μL菌液涂布于相應抗性平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日在同抗性平板上挑取菌落進行純化培養(yǎng).通過電轉化將質粒pCP21、pCE40依次轉入純化菌種中，然后在卡那霉素抗性平板與麥康凱培養(yǎng)基上進行篩選.通過PCR產(chǎn)物凝膠電泳與測序驗證lacZ與stm4351是否替換成功.

1.3 構建雙缺失和三缺失菌株

參照文獻[13]制備裂解液：將供體菌過夜培養(yǎng)，取0.3 mL菌液加入2.3 mL P22肉湯中，培養(yǎng)8 h后轉到2 mL離心管中，10 000 r·min-1離心2 min，取上清液用CHCL3滅菌，獲得裂解液.

轉導：將受體菌過夜培養(yǎng)，取100 μL菌液與50 μL裂解液(1∶50)混勻，在37 ℃搖床中孵育1 h后涂布于相應抗性選擇培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng).

分別將基因缺失株Δhfq∷tetRA、ΔgcvB∷cat和Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat作為供體菌，stm4351缺失株作為受體菌進行轉導.通過抗性平板進行篩選，獲取雙缺失菌株、三缺失菌株：stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat.

1.4 LacZ活性測定

參照文獻[14]，將Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat培養(yǎng)至D600 nm=0.3～0.5，記錄D600 nm值.取0.1 mL菌液，用Z buffer定容至1 mL，加入0.2 mL ONPG (4 mg·mL-1)開始反應，記錄加入時間(t0)；當液體變?yōu)辄S色時加入0.5 mL 1 mol·L-1Na2CO3終止反應，記錄終止時間(tf);將試管中液體以5 000 r·min-1離心30 s后，以Z buffer作空白對照，測D420 nm值，記錄數(shù)據(jù).計算LacZ活性.

1.5 stm4351轉錄量測定

參照文獻[15]，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書，利用引物P9、P10進行PCR擴增.擴增體系為上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×Taq DNA master mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL、DNA模板4 μL.擴增條件：95 ℃預變性30 min；95 ℃變性5 s、 60 ℃退火30 s，35個循環(huán).

提取各菌株的總RNA樣本，將其反轉錄為cDNA，以此作為模板，參考SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，進行兩步法反應.擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，39個循環(huán).每個樣本3個重復，采用2-ΔΔCt法[16]計算相關基因mRNA的轉錄水平.

2 結果與分析

2.1 Δstm4351∷lacZ的構建結果

對構建的菌株進行PCR驗證，獲得目的條帶并測序(圖1，圖2).與原片段進行對比發(fā)現(xiàn)，stm4351成功被lacZ基因替換，獲得菌株Δstm4351∷lacZ.

M.DL2 000 marker；1.stm4351驗證.圖1 stm4351基因與lacZ融合的PCR檢測Fig.1 PCR detection on lacZ fusion of stm4351 gene

灰色為LT2菌株與stm4351缺失菌株上游同源序列；黑色框中為起始密碼子；劃線部分為替換基因序列.圖2 lacZ基因替換stm4351基因的部分序列Fig.2 Partial sequence of stm4351 gene replaced by lacZ gene

2.2 雙缺失、三缺失菌株的構建結果

通過轉導，對各菌株進行PCR鑒定，再進行PCR凝膠電泳(圖3)，成功構建出缺失菌株.

M.DL2 000 marker；1.stm4351驗證(660 bp)；2.gcvB驗證(696 bp)；3.hfq驗證(1 964 bp).圖3 stm4351 ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat菌株的PCR檢測Fig.3 PCR detection on stm4351 ΔgcvB∷cat， stm4351Δhfq∷tetRA， stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat

2.3 基因缺失對LacZ活性的影響

將Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat菌株分別在麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長出的菌落均為紅色(圖4).這表示lacZ基因已經(jīng)成功將stm4351替換，且各菌株均具備發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的能力.

1.Δstm4351∷lacZ; 2.stm4351ΔgcvB∷cat; 3.stm4351Δhfq∷tetRA; 4.stm4351Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat.圖4 基因缺失菌株在麥康凱培養(yǎng)基上的生長情況Fig.4 Growth of gene deletion strains in Maconkey medium

由圖5可以看出，與對照組WT(Δstm4351∷lacZ)相比，gcvB或hfq缺失以及gcvB與hfq同時缺失后，LacZ活性均有所上升,分別上升2.6、3.4、4.2倍.由此說明，gcvB缺失后stm4351蛋白表達量變化顯著(P<0.05)，hfq單缺失及hfq與gcvB同時缺失后stm4351蛋白表達量變化極顯著(P<0.01)

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01).圖5 不同基因缺失菌株的β-半乳糖苷酶活性Fig.5 β-galactosidase activity in different gene deletion strains

2.4 基因缺失對stm4351轉錄水平的影響

由圖6可以看出，與對照組LT2相比，hfq缺失后stm4351的轉錄量極顯著下降(P<0.01)，而gcvB缺失及hfq與gcvB同時缺失后stm4351的轉錄量變化不顯著(P>0.05).

圖6 不同基因缺失菌株的stm4351相對轉錄量Fig.6 Relative transcription levels of stm4351 in different gene deletion strains

3 討論

細菌中存在一類sRNA，長度為40～400 nt，能進行轉錄但不進行翻譯，對細菌中重要基因的表達有抑制或激活作用，進而維持細菌的穩(wěn)定及調節(jié)細菌重要的生命活動和致病性[17].有研究認為，sRNA結合在核糖體結合位點的附近，占據(jù)核糖體與mRNA的結合位點，以抑制翻譯起始從而刺激mRNA的降解[18].根據(jù)編碼調控方式，sRNA分為兩類：一類為基于堿基對完全互補配對的順式編碼調控sRNA；另一類為通過不完美的堿基配對發(fā)揮調控功能的反式編碼調控sRNA.反式編碼調控sRNA在發(fā)揮其調控作用時常存在一種伴侶蛋白Hfq[19].Hfq是一種保守的細菌RNA結合蛋白，是RNA結合蛋白的Sm樣家族的成員之一，充當調節(jié)性RNA伴侶，能促進sRNA與其mRNA靶標之間的堿基配對，并直接調節(jié)某些mRNA的翻譯，進而影響特定轉錄物的翻譯和更新.GcvB是革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門菌)中反式編碼調控sRNA中的一種，與伴侶蛋白Hfq協(xié)同作用，對靶基因產(chǎn)生調控作用.

Sharma et al[8]通過RNA混合算法(hybrid algorithm)對鼠傷寒沙門菌進行預測，認為stm4351為GcvB的靶基因.Montaseri et al[20]使用gRNA進行預測，得到了同樣的結論.本研究結果顯示：在蛋白水平上，gcvB或hfq缺失后，LacZ活性均有所上升；gcvB與hfq同時缺失后，stm4351基因的表達水平比單缺失菌株高.因此，可推測GcvB、Hfq均對stm4351的表達存在抑制作用，且在Hfq的輔助作用下，GcvB對stm4351表達的抑制作用增強.在mRNA水平上，當hfq缺失后，stm4351轉錄量顯著下降，說明在mRNA水平上，GcvB僅與stm4351結合，并未表現(xiàn)明顯的調控作用.sRNA作為轉錄后調控因子，與靶標mRNA 5′UTR區(qū)域進行堿基配對，從而占據(jù)核糖體與mRNA的結合位點，抑制mRNA的翻譯，使得mRNA失去核糖體保護而被降解[21].由此推測,GcvB極有可能通過堿基配對與Hfq結合,再與stm4351形成GcvB-Hfq-stm4351的復合體，以此競爭核糖體與mRNA的結合位點，使得核糖體不能結合到鏈上，從而抑制stm4351的轉錄.gcvB缺失后，stm4351轉錄量并未產(chǎn)生顯著變化，說明Hfq還可能與其他sRNA結合進行相應的調節(jié)作用，也可能通過其他途徑或方式進行調節(jié).gcvB與hfq同時缺失也未使stm4351轉錄量發(fā)生顯著變化，推測另一種調控stm4351基因轉錄或翻譯的機制被激活,且這種機制可能受GcvB或Hfq的負調控,該機制值得進一步探究.

4 結論

本試驗成功構建了沙門菌基因缺失菌株Δstm4351∷lacZ、stm4351ΔgcvB∷cat、stm4351Δhfq∷tetRA、stm4351 Δhfq∷tetRAΔgcvB∷cat.沙門菌中GcvB、Hfq均能夠對stm4351的翻譯產(chǎn)生抑制作用；GcvB在伴侶蛋白Hfq的輔助作用下對stm4351的抑制作用增強；Hfq可能通過2種或更多的途徑對stm4351進行調控；Hfq對stm4351的保護或激活作用可能受到GcvB的影響.