沙門(mén)菌伴侶蛋白Hfq及RybB對(duì)外膜蛋白相關(guān)基因fadL、ompN、ybfM的作用

令狐遠(yuǎn)鳳, 楊 陽(yáng), 潘 永, 段世宇, 張家莉, 張寶太, 楊 琦

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；2.貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025)

沙門(mén)氏菌(Salmonella)為腸桿菌科沙門(mén)氏菌屬成員,可引起人與動(dòng)物多種疾病，在全世界均有發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.RybB是長(zhǎng)度約為81 nt并依賴伴侶蛋白Hfq的sRNA，在大腸桿菌與沙門(mén)氏菌中，RybB是已知調(diào)節(jié)外膜蛋白(outer membrane proteins, OMPs)合成的sRNA中具有最廣泛的靶標(biāo)mRNA[1].沙門(mén)氏菌RybB控制著17種以上的mRNA[2]，RybB與細(xì)胞外應(yīng)激因子σE相關(guān)，當(dāng)OMPs由于外部因素(如熱休克、接觸乙醇、抗菌肽、高分子)和細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行穩(wěn)定期時(shí)，會(huì)出現(xiàn)蛋白折疊錯(cuò)誤或損傷等狀況，并誘導(dǎo)與σE相關(guān)的細(xì)胞外應(yīng)激反應(yīng)[3]，從而使RybB立即限制OMPs合成.OMPs參與細(xì)菌物質(zhì)的代謝、運(yùn)輸、維持細(xì)菌正常形態(tài)等生命活動(dòng).在部分革蘭氏陰性菌中，OMPs已被公認(rèn)為是宿主免疫識(shí)別的重要因子，與細(xì)菌的致病性息息相關(guān).fadL、ompN、ybfM在沙門(mén)氏菌中均參與OMPs的合成，fadL可在革蘭氏陰性菌中編碼外膜通道蛋白,參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[4]；ompN編碼外膜上的孔蛋白，可能參與糖的轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種細(xì)胞過(guò)程，可作為潛在的疫苗候選者；ybfM編碼了可被殼二糖利用的OMPs.在大腸桿菌與沙門(mén)氏菌中，RybB sRNA與mRNA 5′-UTR區(qū)域結(jié)合可抑制多個(gè)主要OMPs的合成[5].

本試驗(yàn)通過(guò)同源重組系統(tǒng)及FLP酶/FRT位點(diǎn)特異性重組，構(gòu)建鼠傷寒沙門(mén)氏菌外膜蛋白相關(guān)缺失菌株,在缺失菌株的基礎(chǔ)上將lacZ基因分別插入fadL、ompN、ybfM缺失區(qū)域并且能進(jìn)行β-半乳糖苷酶的表達(dá).同時(shí)根據(jù)RybB基因序列，進(jìn)行鼠傷寒沙門(mén)氏菌中部分RybB(GGAGCCCATC)缺失菌株與RybB全缺失菌株的構(gòu)建.通過(guò)P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，以鼠傷寒沙門(mén)氏菌Hfq、RybB缺失菌株作為供體菌株，將相應(yīng)的缺失轉(zhuǎn)入顏色指示菌株中，構(gòu)建相應(yīng)的Hfq缺失、RybB缺失、Hfq&RybB雙缺失后的顏色菌株，通過(guò)β-半乳糖苷酶活性分析及qPCR探究伴侶蛋白Hfq與RybB sRNA 對(duì)外膜蛋白ybfM所產(chǎn)生的調(diào)控作用，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

鼠傷寒沙門(mén)氏菌參考菌株LT2(GenBank：NC_003197.265)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌7455(攜帶質(zhì)粒pKD46)均由法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心(CNRS)分子遺傳學(xué)Bossi實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng).

質(zhì)粒pKD46(GenBank：AY048746.1)、質(zhì)粒pCP20(GenBank：AY048744.1)、質(zhì)粒pCE40(GenBank：AY061944.1)、質(zhì)粒pKD3(GenBank：AY048742.1)、質(zhì)粒pKD13(GenBank：AY048744.1)均由法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心(CNRS)分子遺傳學(xué)Bossi實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng).

1.2 主要試劑

DL2000 plus DNA Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix、Pfu DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、dNTPs Mix、卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán)霉素購(gòu)自北京Solarbio公司；瓊脂糖購(gòu)自上海英濰捷基公司；核酸染料Goldview購(gòu)自Biodee，QIAquick PCR Purification Kit (50)、Gel Extration KIT膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；50×TAE Buffer.

1.3 構(gòu)建缺失株

構(gòu)建缺失株LT2 ΔfadL∷MudK、LT2 ΔompN∷MudK、LT2 ΔybfM∷MudK、LT2 ΔRybB∷cat、ΔRybB(GGAGCCCATC)∷cat，根據(jù)GeneBank上LT2菌株的fadL、ybfM、ompN基因序列，設(shè)計(jì)同源重組引物P1(F)與P2(F)、P5(Y)與P6(Y)、P9(O)與P10(O)用于對(duì)應(yīng)菌株構(gòu)建，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成(表1).

利用λ-Red同源重組方法，以質(zhì)粒 pkD13為模板，引物 P1、P2，PCR體系為8 μL pKD13(1∶20)、13 μL ddH2O、上下游引物各2 μL、Green Taq Mix 25 μL，程序?yàn)?5 ℃變性10 s、53～60 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s的30個(gè)循環(huán)，所得目的片段按照試劑盒步驟進(jìn)行純化并于4 ℃保存.在含有L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)pKD46，D600 nm值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，將其菌液制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞.將打靶片段電轉(zhuǎn)化至pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物于LB平板(含50 μg·mL-1的卡那霉素)上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜.經(jīng)PCR篩選出fadL基因替換缺失株LT2 ΔfadL∷Kn.將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LT2 ΔfadL∷Kn缺失株中，在LBA中進(jìn)行培養(yǎng)篩選，獲得菌株 fadL-pcp20，將質(zhì)粒Pce40轉(zhuǎn)入菌株fadL-pcp20，通過(guò)抗性平板篩選出具有Kn抗性，在麥康凱平板上呈現(xiàn)紅色的菌株命名為ΔfadL∷MudK，通過(guò)PCR與測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建出菌株LT2 ΔfadL∷MudK.其余缺失株按相同方法分別構(gòu)建出LT2 ΔompN∷MudK、LT2 ΔybfM∷MudK.以質(zhì)粒pkD3為模板，用相同體系和程序構(gòu)建出LT2 ΔRybB∷cat，LT2ΔRybB(GGAGCCCATC)∷cat.

1.4 P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建缺失菌株

將鼠傷寒沙門(mén)氏菌Hfq、RybB缺失菌株作為供體菌株，將顏色構(gòu)建菌株LT2 ΔfadL∷MudK、LT2 ΔompN∷MudK、LT2 ΔybfM∷MudK作為受體菌，把存有相應(yīng)菌株的甘油于冰上進(jìn)行解凍，按照1∶100的比例，取50 μL甘油于5mL Kn+LB中，在37 ℃、170 r·min-1搖床中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng).取20 μL的供體菌borth至1.5 mL離心管，按1∶50加入980 μL無(wú)菌PBS中進(jìn)行稀釋.分別取受體菌50、100 μL稀釋后供體菌borth至2.0 mL EP管中，混勻.將2.0 mL離心管置于37 ℃搖床進(jìn)行孵育1 h后，取20 μL在相應(yīng)抗性LB平板進(jìn)行涂布篩選.次日取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng).

1.5 β-半乳糖苷酶活性分析

取50 μL待測(cè)菌株按照1∶50的比例置于5 mL Kn+LB中，在37 ℃、170 r·min-1搖床中進(jìn)行培養(yǎng)至D600 nm=0.3～0.5.抽取菌液1 mL置于比色皿中測(cè)D600 nm.從比色皿中取0.1 mL至新試管中，以Z buffer定容到1 mL.向試管中添加數(shù)滴甲苯，在42 ℃水浴搖床中進(jìn)行振蕩2 h.將試管轉(zhuǎn)于28 ℃水浴鍋中放置5 min，通過(guò)向試管中加入0.2 mL 鄰硝基苯β-D-半乳糖吡喃糖苷(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside，ONPG)(4 g·L-1)并記錄加入時(shí)間(t0).當(dāng)試管中呈現(xiàn)出黃色時(shí)，加入0.5 mL 1mol·L-1Na2CO3終止反應(yīng)，記錄終止時(shí)間(tf).將試管中終止所得液體進(jìn)行1次離心，取上清液 1 mL置于比色皿中，以Z buffer 管作為空白對(duì)照，測(cè)D420 nm.通過(guò)公式計(jì)算β-半乳糖苷酶活性.

β-半乳糖苷酶活性=(1 000×D420 nm)/[(tf-t0)×D600 nm]

1.6 fadL、ompN、ybfM轉(zhuǎn)錄水平的變化

根據(jù)GenBank上鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2 16s RNA、ybfM、fadL、ompN序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的qPCR引物(表2)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成.

表2 qPCR引物Table 2 Primers used for qPCR amplification

根據(jù)R6950 Bacterial RNA Kit，提取鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2的RNA，以相應(yīng)的菌株RNA作為模板，按照HiScriptⅢRT superMix for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成.以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR，通過(guò)GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失菌株的構(gòu)建及PCR鑒定

利用λ-Red同源重組系統(tǒng)將mudk與STMLT2 wild株候選基因融合，結(jié)果表明，菌株經(jīng)特異性引物PCR 擴(kuò)增后，出現(xiàn)與預(yù)期相符的條帶，分別為958、1 297、962 bp(圖1)，深圳華大生物科技有限公司的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果也與預(yù)期相符，本試驗(yàn)成功構(gòu)建STMLT2fadL基因MudK融合菌株、STMLT2ompN基因 MudK融合菌株、STMLT2ybfM基因MudK融合菌株.將構(gòu)建的RybB相關(guān)缺失菌株DNA作為模板，通過(guò)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段為472 bp，菌株LT2∷cat、LT2 ΔRybB(GGAGCCCATC)∷cat、LT2 ΔRybB∷cat作為模板擴(kuò)增片段分別為1 477、1 470、1 227 bp(圖2)，將鼠傷寒沙門(mén)菌LT2∷cat、LT2 ΔRybB(GGAGCCCATC)∷cat、LT2 ΔRybB∷cat PCR產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測(cè)序，成功構(gòu)建LT2 ΔRybB(GGAGCCCATC)∷cat、LT2 ΔRybB∷cat.

A：fadL缺失菌株； B：ompN缺失菌株；C：ybfM缺失菌株；M：2000 bp DNA marker；泳道1、3、6分別為L(zhǎng)T2 ΔfadL∷MudK、LT2 ΔompN∷MudK、LT2 ΔybfM∷MudK；泳道2、4、5均為空白對(duì)照.圖1 fadL、ompN、ybfM缺失菌株的PCR電泳擴(kuò)增圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplifications of fadL, ompN and ybfM deletion strains

M:2 000 bp DNA marker；1:鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2；2:LT2∷cat；3:LT2 ΔRybB (GGAGCCCATC)∷cat；4:LT2 ΔRybB∷cat.圖2 LT2 RybB缺失菌株的PCR電泳圖Fig.2 PCR electropherogram of LT2 RybB deletion strain

2.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建

以LT2 Δhfq∷TetRa、RybB分別作為供體菌株，通過(guò)P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)，將hfq、RybB缺失片段轉(zhuǎn)入LT2fadL∷MudK、LT2 ΔompN∷MudK、LT2ybfM∷MudK中，在顏色指示菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行hfq、rybB的單缺失菌株、雙缺失菌株的構(gòu)建(圖3).

A:hfq菌株構(gòu)建；B:RybB菌株構(gòu)建；M:2 000 bp DNA marker；1：LT2 ybfM∷MudK Δhfq∷TetRa;2：LT2 ybfM∷MudK ΔRybB∷cat；3：LT2 ybfM∷MudK Δhfq∷TetRa ΔRybB∷cat；4：LT2 ompN∷MudK Δhfq∷TetRa；5：LT2 ompN∷MudK ΔrybB∷cat；6：LT2 ompN∷MudK Δhfq∷TetRa ΔrybB∷cat；7：LT2 fadL∷MudK Δhfq∷TetRa;8、9：LT2 fadL∷MudK ΔrybB∷cat；10、11：LT2 fadL∷MudK Δhfq∷TetRa ΔrybB∷cat.圖3 菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建結(jié)果Fig.3 Verification of strain transduction and construction

2.3 hfq及rybB對(duì)外膜蛋白的作用

根據(jù)β-半乳糖苷酶活性分析hfq、rybB對(duì)fadL、ompN、ybfM的蛋白表達(dá)的影響(圖4).結(jié)果表明，當(dāng)hfq缺失后，fadL蛋白表達(dá)下調(diào)，而ybfM、ompN蛋白表達(dá)水平上調(diào)，分別為未缺失株的0.43、1.3、134.6倍；當(dāng)rybB缺失后，fadL、ybfM、ompN的蛋白表達(dá)上調(diào)，分別為未缺失株的1.2、1.75、6.7倍；當(dāng)hfq與rybB共同缺失后，相較于未缺失菌株，fadL的蛋白水平下調(diào)，是未缺失的0.47倍，ybfM和omoN的蛋白水平上調(diào)，是未缺失的1.8和336.5倍.

圖4 鼠傷寒沙門(mén)氏菌顏色指示菌株的β-半乳糖苷酶活性 圖5 rybB、hfq基因單缺失或雙缺失后fadL、ompN、ybfM基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 β-galactosidase activity of S.typhimurium as color indicator strain Fig.5 Transcriptional levels of fadL, ompN and ybfM genes after single or double deletion of rybB and hfq genes

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖5)，與鼠傷寒沙門(mén)氏菌相比，LT2 Δhfq∷TetRa中fadL基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)6.13倍，而ompN、ybfM基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分別上調(diào)了10.39、15.7倍；LT2 ΔrybB∷cat中fadL、ybfM基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分別下調(diào)2.44、2.32倍，ompN基因上調(diào)了3.68倍；LT2 ΔrybB∷cat Δhfq∷TetRa中fadL基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)1.12倍，而ompN、ybfM上調(diào)6.80、2.85倍.

通過(guò)qPCR探究RybB中GGAGCCCATC缺失對(duì)fadL、ompN、ybfM轉(zhuǎn)錄水平的影響(圖6)，qPCR結(jié)果顯示，當(dāng)RybB缺失后，ybfM、ompN、fadL轉(zhuǎn)錄量分別下調(diào)2.32倍、上調(diào)3.68倍、下調(diào)2.44倍；當(dāng)RybB中(GGAGCCCATC)缺失后，ybfM、ompN、fadL轉(zhuǎn)錄量分別上調(diào)3.98、175.50、3.47倍；當(dāng)RybB缺失后，Δhfq對(duì)ybfM、ompN、fadL轉(zhuǎn)錄量分別由15.70、10.39、6.13倍變?yōu)?.85、6.84、1.12倍.當(dāng)RybB中(GGAGCCCATC)缺失后，Δhfq對(duì)ybfM、ompN、fadL轉(zhuǎn)錄量分別由15.70、10.39、6.13倍變?yōu)?.24、151.30、3.52倍.

圖6 ΔrybB(GGAGCCCATC)對(duì)fadL、ompN、ybfM基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Effect of ΔrybB (GGAGCCCATC) on transcriptional levels of fadL, ompN and ybfM genes

3 討論

細(xì)菌的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程.RNA伴侶蛋白Hfq參與許多細(xì)菌生命活動(dòng)中的眾多網(wǎng)絡(luò)監(jiān)管，被視為轉(zhuǎn)錄后網(wǎng)絡(luò)的核心組成部分.與Hfq相關(guān)的sRNA可能構(gòu)成迄今已知的最大的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)組，模型腸桿菌(如大腸桿菌或鼠傷寒沙門(mén)氏菌)可能表達(dá)其中的100種以上.依賴于Hfq的sRNA的長(zhǎng)度通常在50～250 nt，結(jié)構(gòu)多樣，并從獨(dú)立的染色體基因轉(zhuǎn)錄而來(lái).通常通過(guò)短而不完善的RNA相互作用(10～25個(gè)堿基對(duì))識(shí)別mRNA的5′區(qū)域，從而負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)翻譯或穩(wěn)定性.RybB是一種響應(yīng)σE激活而合成的sRNA，下調(diào)幾種主要OMPs的表達(dá).OMPs的過(guò)度積累是導(dǎo)致σE激活的信號(hào)之一，因此RybB有助于維持OMPs的穩(wěn)態(tài)，并作為自體控制的基礎(chǔ).

為確定Hfq、rybB對(duì)fadL、ompN、ybfM的調(diào)控作用，本試驗(yàn)在構(gòu)建出LT2fadL∷MudK、LT2ompN∷MudK、LT2ybfM∷MudK顏色指示菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行hfq、rybB的單缺失、雙缺失菌株的構(gòu)建，通過(guò)β-半乳糖苷酶活性與qPCR分別探究蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平的影響.結(jié)果表明，在蛋白水平上，ompN對(duì)hfq的缺失并不敏感，而rybB缺失后，ompN表達(dá)呈一定程度的上調(diào).有研究表明[5]，RybB可通過(guò)與ompNAUG起始密碼子的下游+4至+11編碼序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，RybB可限制ompN的蛋白表達(dá)，造成約14倍差異變化；Dam et al[6]通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌ompN-lacZ菌株和β-半乳糖苷酶活性分析,在熱激條件下，通過(guò)IPTG的抗σ因子RseA的過(guò)表達(dá)，使細(xì)菌暫時(shí)耗盡σE，當(dāng)RybB、hfq缺失后，ompN-lacZ表達(dá)量無(wú)變化，rybB、hfq可能并不直接對(duì)ompN進(jìn)行作用，而是通過(guò)σE因子對(duì)ompN進(jìn)行調(diào)控.而在轉(zhuǎn)錄水平上，hfq、RybB基因缺失能夠?qū)е耾mpN轉(zhuǎn)錄水平的提高，而hfq與rybB同時(shí)缺失時(shí)，雖然ompN的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但低于hfq單獨(dú)缺失的變化.在蛋白水平上，hfq、rybB對(duì)ybfM具備強(qiáng)烈的抑制調(diào)控作用，而在轉(zhuǎn)錄水平上，rybB缺失導(dǎo)致ybfM轉(zhuǎn)錄水平降低，即使hfq缺失能夠引起ybfM轉(zhuǎn)錄量的提升，但當(dāng)RybB與hfq共同缺失時(shí)，ybfM轉(zhuǎn)錄量顯著低于hfq單獨(dú)缺失.rybB與ybfMAUG起始密碼子的下游+12至+18的編碼序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)rybB缺失后，ybfM的蛋白表達(dá)量幾乎翻了一番[5].hfq可控制micM對(duì)ybfM的抑制作用[7,8].試驗(yàn)結(jié)果表明，hfq缺失后可導(dǎo)致fadL蛋白表達(dá)量出現(xiàn)降低，RybB缺失后，fadL蛋白表達(dá)量升高，然而在轉(zhuǎn)錄水平上，RybB、hfq均導(dǎo)致fadL轉(zhuǎn)錄水平的降低，同時(shí)缺失RybB與hfq時(shí)，fadL轉(zhuǎn)錄量顯著低于單缺失.RybB與fadLAUG起始密碼子的下游+43至+50的編碼序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)[9]，Hfq直接參與RybB與fadLmRNA相互作用[10].Papenfort et al[9]將攜帶表達(dá)質(zhì)粒pBAD-RybB的沙門(mén)氏菌培養(yǎng)至D600 nm為1.5，并通過(guò)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)pBAD-RybB表達(dá)10 min后，ompN、fadLRNA分別降低6倍與8倍.本試驗(yàn)僅進(jìn)行RybB缺失，導(dǎo)致ompN轉(zhuǎn)錄水平升高約6.7倍，然而fadL的轉(zhuǎn)錄水平下降，蛋白表達(dá)水平變化與轉(zhuǎn)錄水平變化不一致的情況，可能與RybB對(duì)fadL、ompN的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)，RybB與ompN起始密碼子的5個(gè)密碼子窗口內(nèi)(+5至+20)進(jìn)行結(jié)合，與fadL的5個(gè)密碼子窗口下游的區(qū)域(+43至+50)進(jìn)行結(jié)合.RybB與相應(yīng)靶mRNA AUG周圍區(qū)域內(nèi)結(jié)合而主動(dòng)抑制靶標(biāo),而結(jié)合的位點(diǎn)可影響靶標(biāo)基因的活性.

RybB以其約+20至+40間序列與RHO非終止子和伴侶蛋白進(jìn)行結(jié)合.探究RybB(+20 to+40)間序列GGAGCCCATC對(duì)RybB與伴侶蛋白Hfq調(diào)控作用的影響，結(jié)果表明，RybB中GGAGCCCATC缺失能可上調(diào)ybfM、ompN、fadL的轉(zhuǎn)錄水平，并使Δhfq對(duì)ybfM、fadL轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用減弱，增強(qiáng)Δhfq對(duì)ompN轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用；而RybB缺失可降低fadL、ybfM的轉(zhuǎn)錄水平、上調(diào)ompN的轉(zhuǎn)錄水平，并降低Δhfq對(duì)ybfM、ompN、fadL轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用.同時(shí)以LT2ybfM∷MudK為基礎(chǔ)，ΔRybB、ΔRybB(GGAGCCCATC)均可提高Hfq對(duì)ybfM的表達(dá)調(diào)控作用.推測(cè)Hfq與RybB對(duì)同一基因可出現(xiàn)同時(shí)抑制、促進(jìn)或一方抑制、促進(jìn)的作用，兩者結(jié)合后可能出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致對(duì)目的基因的調(diào)控功能出現(xiàn)差異，而RybB中的序列GGAGCCCATC對(duì)Hfq、RybB的調(diào)控作用是不可缺少的，當(dāng)序列GGAGCCCATC缺失后，導(dǎo)致Hfq、RybB結(jié)合能力減弱.序列GGAGCCCATC缺失是否影響sRNA RybB與Hfq的作用還需進(jìn)一步的探索.