偽狂犬病毒FJ 2012株感染湖羊腎臟的轉(zhuǎn)錄組譜特征及對FoxO通路的影響

彭瑤順, 李方瑾, 徐佳匯, 戰(zhàn) 婷, 王全溪,2, 周倫江

(1.福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建 福州 350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室(福建農(nóng)林大學)，福建 福州 350002；3.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

偽狂犬病是偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)感染多宿主的一種急性傳染病，宿主包括豬、牛、羊等經(jīng)濟動物及一些野生動物[1].我國羊偽狂犬病毒感染最早報道于20世紀50年代，近年來由于豬的流動性增加，以及羊的養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴大，羊感染PRV的報道也逐年增多[2].羊感染PRV主要為口吐白沫，皮膚局部癢，體溫升高，最后嚴重者死亡，剖檢病理變化常見于肺出血明顯，腦實質(zhì)水腫出血，腎臟表面有出血點[3].但是有關(guān)羊感染PRV的致病機制研究鮮有報道.

基于RNA-seq的高通量測序主要應用于篩選差異基因、預測新轉(zhuǎn)錄本及基因功能分析等方面，有助于從分子水平研究病毒入侵宿主以及宿主的防御機制[4,5].Fan et al[6,7]基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對感染了PRV的大鼠腦、肺、脾臟等組織進行分析，結(jié)果表明，miR-122-5p具有調(diào)控NOD2-RIP2信號通路的功能，從而抑制該信號通路調(diào)控的促炎反應，為偽狂犬病毒逃避宿主免疫應答的研究提供依據(jù).

湖羊?qū)儆诰d羊，在南方如江浙一帶飼養(yǎng)相對較多[8].腎臟是PRV侵害湖羊的器官之一.PRV感染如何導致腎臟病變，通過何種途徑對其進行調(diào)控尚未明了.本試驗基于PRV FJ 2012株，以湖羊為模式動物，借助RNA-seq技術(shù)，對PRV人工感染湖羊的腎臟轉(zhuǎn)錄組進行分析，了解偽狂犬病毒感染羊的致病機制.

1 材料與方法

1.1 動物及分組

5月齡湖羊8頭，均購買自閩侯某大型養(yǎng)殖場，并經(jīng)PCR檢測確認PRV抗原陰性和ELISA檢測抗體陰性.PRV FJ 2012株由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存并提供.動物使用全價料進行適應性飼養(yǎng)，隨后將湖羊隨機且平均分成空白對照組和PRV攻毒組.PRV攻毒組(5頭)頸部皮下注射病毒懸液1 mL·只-1(TCID50=103mL)，空白對照組每頭樣本注射滅菌生理鹽水1 mL.攻毒后7 d內(nèi)每日進行臨床觀察，對有呼吸困難、共濟失調(diào)等臨床癥狀的湖羊進行解剖，采集腎臟，保存于已裝有RNAhold的5 mL離心管，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃凍存.

1.2 總RNA的提取

腎組織總RNA提取按照RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)說明書進行，使用Nanodrop 2000測定樣品RNA濃度和光密度值D，并使用1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，符合質(zhì)量的RNA送至北京諾禾致源基因公司進行轉(zhuǎn)錄組測序分析.

1.3 樣品質(zhì)量測序評估分析

使用Illumina公司的第二代測序技術(shù)，獲取了送檢樣品的原始數(shù)據(jù).由于在測序過程中伴隨著核酸片段的打斷以及接頭等過程，所以序列數(shù)據(jù)參差不齊.因此，需要對獲得的數(shù)據(jù)進行篩選.該過程包含：剔除帶接頭的reads、含有N的reads以及Q≤20的低質(zhì)量reads[9].同時，對去雜質(zhì)后的干凈數(shù)據(jù)進行Q20、Q30和GC含量計算.使用CASAVA處理獲取的原始數(shù)據(jù)并用于后續(xù)分析[8].

1.4 差異表達基因分析

根據(jù)基因長度計算每個基因的FPKM，并計算映射到該基因的讀數(shù).FPKM指每百萬堿基對測序的轉(zhuǎn)錄本序列片段的每千堿基片段的預期數(shù)量，是當前最常用的檢測評估方法，以|Log2(FoldChange)|>0,P<0.05為差異表達基因[8].

兩組之間的差異表達使用DESeq2軟件(1.16.1)進行分析.Benjamini和Hochberg調(diào)整P值，P<0.05的基因即為差異表達基因.對差異檢驗的P-value作多重假設檢驗校正，通過控制偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)決定P-value的域值[8].

1.5 GO和KEGG富集分析

GO (gene ontology)富集分析主要通過ClusterProfiler (3.4.4)軟件對所有篩選的差異表達基因進行生物功能分析.將閾值定為P≤0.05，對符合要求的GO term進行差異富集.通過Cluster Profiler (3.4.4)軟件將差異表達基因富集到不同的KEGG通路，分析生物體內(nèi)的各種信號通路.通路顯著性富集分析以KEGG pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組相比較后差異表達基因中顯著性富集的pathway[8].

1.6 差異基因的qPCR檢測結(jié)果

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本試驗著重對FOXO通路的差異表達基因進行了qPCR驗證.首先在NCBI中查找基因序列(STAT3：XM_015098787.2，F(xiàn)oxO3：NM_001267889.1，BCL6：XM_012097363.3，ATG8：XM_012175401.3，IL6：NM_001009392.1，SGK2：XM_004014577.4，PEPCK：XM_027977017.1，ACTROGIN：XM_004011657.4，IRS：XM_015093559.2，β-肌動蛋白：X00182.1)，并采用Primer 15.0設計特異性引物(表1).將PRV感染后所采集的羊腎臟進行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為qPCR模板.反應條件為：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s+60 ℃ 30 s，40個循環(huán).β-肌動蛋白基因作為參考基因，使用-ΔΔCt法計算差異表達基因的log2(fold change).

表1 qPCR引物的序列Table 1 Sequences of qPCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果分析

PRV FJ 2012株人工感染湖羊，體溫最高達42.5 ℃，皮膚瘙癢，神經(jīng)癥狀和口吐白沫.感染后第5天共死亡4只，剖檢采集腎臟.感染后第7天，剖檢感染組和對照組所有羊，采集腎臟.提取所有樣品總RNA送生物公司測序.對照組和人工感染組腎臟的8個樣本，通過轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析結(jié)果表明(表2)，共獲得測序長度為43 776 562～48 202 572個原始片段(raw reads)，各樣本有效片段(clean reads)最低可達到6.4G，Q30(測序錯誤率小于0.1%)均在93.64%以上，GC含量均在47.95%以上，證明數(shù)據(jù)可靠，可以進行后續(xù)的生物學分析.

2.2 差異表達基因的篩選

通過對轉(zhuǎn)錄組測序中篩選到的有效數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)PRV FJ 2012株感染湖羊與空白對照組湖羊的腎臟有2 679個差異表達基因，其中1 269個基因下調(diào)，1 410個基因上調(diào)(圖1)，表明偽狂犬病毒感染湖羊腎臟，激活腎臟啟動大量的基因應答.

圖1 PRV感染湖羊腎臟中差異表達基因篩選結(jié)果Fig.1 Screening of differentially expressed genes in Hu sheep kidney infected with PRV

2.3 GO富集分析

將篩選到的差異表達基因進行GO富集分析，GO分為3個主要功能類別，即生物過程、細胞組分和分子功能.選取富集基因數(shù)大于2個的GO條目，按照富集顯著性P-value值，篩選到顯著富集的前10個GO條目(圖2).在生物過程方面，顯著富集的GO Term主要是蛋白折疊、GPI錨定代謝過程、蛋白質(zhì)脂質(zhì)化功能；在細胞組分方面，顯著富集的GO Term主要是細胞核、染色質(zhì)、細胞外間隙等；在分子功能方面，顯著富集的GO Term主要是未折疊蛋白結(jié)合、熱休克蛋白結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合等.

圖2 差異表達基因的GO富集分析結(jié)果Fig.2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 KEGG通路分析

為了對差異表達基因進行KEGG通路分析，使用在線分析軟件DAVID將基因的ID號比對到KEGG數(shù)據(jù)庫，富集出病毒感染后差異表達的基因可能參與的通路.通過對攻毒組與空白組富集到的DEGs分析表明，富集到的差異通路有316條，其中差異顯著的通路有7條(P<0.05)(圖3).包括FoxO信號通路，真核生物核糖體生物發(fā)生，TNF信號通路，沙門氏菌感染，IL-17信號通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabeticcomplications)等信號通路.

圖3 差異表達基因的KEGG富集結(jié)果Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

2.5 qPCR驗證腎臟中FOXO信號通路DGEs的mRNA表達結(jié)果

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本試驗選擇FOXO3通路，驗證了STAT3、IL-6、FOXO3、BCL6、ATG8、IRS、SGK2、ATROGIN、PEPCK等DEGs.攻毒組與空白對照組相比STAT3、IL-6、FOXO3、BCL6、ATG8等基因的mRNA水平上調(diào)，IRS、SGK2、ATROGIN、PEPCK的mRNA水平下調(diào)，qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致(表3).可見，轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)可靠，PRV感染湖羊腎臟調(diào)控了腎臟中FOXO3通路的多個基因表達.

表3 qPCR驗證腎臟中差異表達基因mRNA的表達結(jié)果Table 3 Validation of mRNA expressions of differentially expressed genes in Hu sheep kidney by qPCR

3 討論

RNA-seq技術(shù)作為新一代的測序技術(shù)，主要應用于檢測差異基因、預測新轉(zhuǎn)錄本以及基因功能分析等方面.RNA-seq技術(shù)有助于從轉(zhuǎn)錄組水平研究病毒入侵宿主以及宿主的分子機制.有研究表明[5]，PRRSV感染豬肺泡巨噬細胞后，與IL-15產(chǎn)生相關(guān)的5個基因(IFNb1、IL-15、IRF1、JAK2和STAT1)均上調(diào)，這部分解釋了PRRSV感染后導致的高炎癥反應.龔小程等[10]利用RNA-seq技術(shù)研究CSFVShimen株與宿主細胞的相互作用，研究表明雙細胞系差異基因主要集中在NF-κB相關(guān)的通路，低NF-κB活性的細胞對流感病毒具有抵抗性，推測CSFV感染過程中NF-κB通路的活化會影響病毒的侵染.Jin et al[11]通過RNA-seq技術(shù)研究表明，PRV感染細胞后長鏈非編碼RNA的沉默LncA02830可顯著上調(diào)IRF3、干擾素β和MX1的轉(zhuǎn)錄水平，抑制PRV-Ⅱ的復制.因此，合理使用RNA-seq技術(shù)有助于深入了解病毒的致病機理.

本試驗對偽狂犬病毒感染湖羊腎臟進行RNA-seq測序共篩選到2 679個DEGs，這些DEGs參與29個生物學功能，主要涉及生物代謝、信號傳導、細胞周期等相關(guān)基因網(wǎng)絡.在分子功能方面的GO功能富集中發(fā)現(xiàn)，未折疊蛋白結(jié)合顯著增多，對KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)PERK蛋白表達上升，這表明PRV感染湖羊腎臟引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激.自噬相關(guān)蛋白基因表達上調(diào)(ATG8,ATG12)，推測偽狂犬病毒導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激后進一步誘導細胞產(chǎn)生自噬，這可能與病毒的復制有關(guān).

已有研究表明[12]，PRV與細胞自噬存在關(guān)聯(lián)，偽狂犬病毒感染早期(0～6 h)促進細胞自噬，后期通過激活PI3K/AKT/mTORC1途徑抑制自噬來增加感染性病毒粒子的數(shù)量.同時，揭示了偽狂犬病毒被膜蛋白US3抑制LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霯C3-Ⅱ的過程.通過偽狂犬病毒侵染PK-15的試驗表明[15]，Beclin1抑制bcl-2與bcl-xl相結(jié)合，再將Neuro-2a細胞人工感染偽狂犬病毒，確認了PRV通過經(jīng)典的Beclin-1-ATG7-ATG5途徑誘導Neuro-2a細胞自噬，促進病毒在體外的復制.

FOXO是轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O.FOXO功能廣泛，參與細胞的自噬、凋亡、新城代謝等過程[13].FOXO受到上游蛋白AKT的調(diào)控，活化的AKT磷酸化FOXO，然后轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，從而失去轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[14].通過對FOXO信號通路分析表明，偽狂犬病毒感染湖羊腎臟會導致IL-6、STAT3、FOXO3、ATG8等基因的mRNA上調(diào).研究顯示，細胞質(zhì)中STAT3通過隔離EIF2AK2以及與其他自噬相關(guān)信號分子如FOXO1和FOXO3相互作用，結(jié)構(gòu)性地抑制自噬.張曉芹通過免疫組織化學和qPCR兩種方法檢測結(jié)腸癌組織中的STAT3和IL-6表達水平，發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)，IL-6-STAT3與結(jié)腸癌發(fā)展有關(guān)[15].VZV在細胞復制過程中，激活STAT3-BNIP3調(diào)節(jié)細胞自噬促進VZV復制[16,17].本試驗通過分析湖羊感染偽狂犬病毒的腎臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了與已知偽狂犬病毒誘導的自噬不同的通路，即IL-6-STAT3-FOXO3-ATG8信號通路與PRV導致的細胞自噬可能存在關(guān)聯(lián).