圓齒野鴉椿Biflorin和Isobiflorin的抗氧化性及其對(duì)H2O2氧化損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用

王金熠, 唐彩婷, 郭夢(mèng)云, 蘇超茹, 梁婷婷, 黃 維,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建高校自然生物資源保護(hù)利用工程技術(shù)研發(fā)中心，福建 福州 350007)

氧化應(yīng)激是指外來(lái)刺激打破機(jī)體氧化還原平衡，引發(fā)大量自由基產(chǎn)生，從而引起基因表達(dá)異常和蛋白分泌失調(diào)等，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的重要因素[1].肝臟通過(guò)氧化還原反應(yīng)對(duì)體內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，氧化應(yīng)激極易引起肝臟損傷[2-4].臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑能導(dǎo)致機(jī)體氧化還原失衡，因此常用于肝病的輔助治療.圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)是福建省民間的傳統(tǒng)藥用植物，其果實(shí)具清熱降毒、抗炎鎮(zhèn)痛的功效，其提取物對(duì)肝組織具較好的抗損傷、抗癌等作用[5-7].本課題組前期在圓齒野鴉椿果皮成分活性的研究中發(fā)現(xiàn)色原酮化合物Biflorin和Isobiflorin[8].研究表明Biflorin和Isobiflorin具有較強(qiáng)的抗炎活性[9]，但抗氧化活性尚未見(jiàn)報(bào)道.本研究利用體外自由基消除試驗(yàn)和對(duì)被氧化劑H2O2破壞的肝細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)Biflorin和Isobiflorin的抗氧化效果，及其對(duì)H2O2氧化后損害的肝細(xì)胞的防護(hù)效果，并探究其可能的影響機(jī)理，為圓齒野鴉椿藥用資源的開(kāi)發(fā)與利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Biflorin和Isobiflorin由課題組制備[10].圓齒野鴉椿成熟果實(shí)于2019年10月采自福建省邵武市天成巖.曬干的果皮粉碎后依次用食用酒精提取，用乙酸乙酯萃取，再分別用硅膠及凝膠柱層析分離純化.經(jīng)ESI-MS和NMR檢測(cè)，并與文獻(xiàn)[11-12]比對(duì)，結(jié)果一致，確認(rèn)為Biflorin和Isobiflorin，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.5%和98.7%.

青霉素—鏈霉素雙抗、DMEM高糖培養(yǎng)基、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)、水楊酸、胎牛血清(FBS)、抗壞血酸(Vitamin C, Vc)、細(xì)胞活性氧試驗(yàn)反應(yīng)試劑盒、核蛋白提取實(shí)驗(yàn)反應(yīng)試劑盒、胰酶溶液、pH7.4 PBS溶液、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)等購(gòu)于索萊寶股份公司；2,2′- 聯(lián)氨-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨鹽(ABTS)、1,1 -二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自默克Sigma-Aldrich公司；TransZol Up Plus RNA試劑盒、TransScriptⅡone-step gDNA Removal and cDNA Synthesis超混液和TransStart Green qPCR超混液購(gòu)自全式金公司； Nrf2、HO-1和NQO-1購(gòu)于Abcam公司，內(nèi)參β-actin、Cytochrome c oxidase subunit 4(COX-4)和二抗購(gòu)于Santa Cruz公司；鹽酸、DMSO及其余試劑均為分析純.

1.2 儀器

qRT-PCR測(cè)定儀(LightCycler 96)由瑞士Roche公司提供；全波段功能酶標(biāo)儀(Varioskan)由美國(guó)Thermo Scientific公司提供；pH計(jì)(PB-20)由德國(guó)Mettler Toledo公司提供；NANODROP 2000由美國(guó)Thermo Scientific公司提供；熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BOX F3)由美國(guó)SYNGENE公司提供；倒置顯微鏡(1X51)由日本Olympus公司提供.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

L02人肝細(xì)胞株(購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù))，培植于添加了10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基(含100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素)，在37 ℃、飽和濕度和5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Formula 371，美國(guó)Thermo Scientific公司)中正常生長(zhǎng).

1.4 DPPH自由基消除試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[13]，取96孔板，每孔加100 μL 0.2 mmol·L-1DPPH及100 μL的不同濃度的樣品液，迅速混勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定光密度D；在相同處理下，以維生素C溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以75%乙醇為空白對(duì)照.DPPH自由基消除率/%=(1-D1/D0)×100，式中，D1為樣品孔或陽(yáng)性對(duì)照孔測(cè)得光密度，D0為空白對(duì)照孔測(cè)得光密度.

1.5 ·OH自由基消除試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[14]，取96孔板，每孔加10 μL 8.8 mmol·L-1H2O2、10 μL 9 mmol·L-1水楊酸溶液、10 μL 9 mmol·L-1FeSO4和120 μL不同濃度的樣品液，迅速混勻，37 ℃水浴15 min，在510 nm處測(cè)定光密度D；在相同處理下，以維生素C溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以75%乙醇為空白對(duì)照.·OH自由基消除率/%=(1-D1/D0)×100.式中，D1為樣品孔或陽(yáng)性對(duì)照孔測(cè)得光密度，D0為空白對(duì)照孔測(cè)得光密度.

1.6 ABTS+自由基消除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[15]，取96孔板，每孔加160 μL ABTS+水溶液和40 μL不同濃度的樣品液，迅速混勻，靜置10 min，在734 nm處測(cè)定光密度D；在相同處理下，以維生素C溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以75%乙醇為空白對(duì)照.ABTS+自由基消除活力/%=(1-D1/D0)×100.式中，D1為樣品孔或陽(yáng)性對(duì)照孔測(cè)的光密度，D0為空白對(duì)照孔測(cè)得的光密度.

1.7 細(xì)胞存活率檢測(cè)

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104個(gè)·mL-1.取96孔板，每孔加入180 μL細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后，每孔加20 μL藥液樣品，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.24 h后，每孔加20 μL 5 g·L-1的MTT溶液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng).4 h后，棄每孔細(xì)胞液，加入150 μL DMSO，在570 nm處測(cè)定光密度D；在相同處理下，設(shè)置調(diào)零孔(無(wú)添加細(xì)胞)和對(duì)照孔(無(wú)添加藥品).細(xì)胞存活率/%=[(D1-D0)/(D2-D0)]×100.式中，D0為調(diào)零孔測(cè)得光密度，D1為藥品注射孔測(cè)的光密度，D2為對(duì)照孔測(cè)得的光密度.

1.8 細(xì)胞清除活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的能力測(cè)定

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104個(gè)·mL-1.取96孔板，每孔加入180 μL細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后，取不同濃度的藥液樣品處理細(xì)胞.2 h后，加入一定濃度下能顯著引起細(xì)胞損傷的H2O2.22 h后，每孔加入150 μL DCFH-DA熒光探針；40 min后，用PBS清洗2遍以清除未結(jié)合的探針；最后，利用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞裂解后活性氧產(chǎn)生的熒光作用強(qiáng)度F(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm).ROS消除率/%=[1-(F試驗(yàn)-F空白)/(F模型-F空白)]×100.

1.9 蛋白表達(dá)的測(cè)定

向L02細(xì)胞加入不同濃度的藥液樣品，24 h后用PBS洗滌后控干.加入漿蛋白抽提試劑并置冰上裂解10 min.在4 ℃、12 000×g下離心10 min，所得上層清液為胞漿蛋白；分離下層沉淀，用抽提核內(nèi)蛋白的試劑渦旋，在4 ℃、12 000×g下離心10 min，所獲得的上層清液為核內(nèi)蛋白.以BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶公司產(chǎn)品)測(cè)定蛋白濃度.取目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h，以相應(yīng)的一抗和二抗反應(yīng)液進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行ECL顯影和圖像拍照.

1.10 mRNA表達(dá)的測(cè)定

采用qRT-PCR法：向L02細(xì)胞加入不同濃度的藥液樣品，24 h后用PBS洗滌后控干；加入Transzol溶液提取總RNA，并測(cè)定其濃度；將所提的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè).β-actin、HO-1、NQO-1和Nrf2的引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如表1所示.

表1 引物列表Table 1 List of primers used in PCR amplification

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)結(jié)果以SPSS 22.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，組間的對(duì)比則用Dunnett檢驗(yàn)，以P小于0.05為具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Biflorin和Isobiflorin的體外抗氧化性

首先，分別對(duì)Biflorin和Isobiflorin的自由基清除能力進(jìn)行DPPH、·OH和ABTS+評(píng)估.結(jié)果表明，當(dāng)濃度為0.05 mg·mL-1時(shí)，Biflorin和Isobiflorin對(duì)DPPH自由基的清除率分別為43.67%±3.24%和47.96%±2.73%，其消除IC50分別為(0.057±0.006)和(0.053±0.005) mg·mL-1，與Vc清除DPPH自由基的能力相當(dāng)(圖1A)；濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)，Biflorin和Isobiflorin對(duì)·OH自由基的消除率分別為53.96%±3.13%和53.56%±3.99%，其消除IC50分別為(0.084±0.008)和(0.076±0.006)mg·mL-1(圖1B)；濃度為0.05 mg·mL-1時(shí)，Biflorin和Isobiflorin對(duì)ABST+自由基的消除率分別為47.72%±3.02%和48.97%±3.91%，其消除IC50分別為(0.055±0.006)和(0.052±0.005) mg·mL-1，略低于Vc對(duì)ABTS+自由基的消除率(圖1C).從上述體外自由基消除試驗(yàn)結(jié)果可知，Biflorin和Isobiflorin具有較強(qiáng)的自由基消除能力.

A.DPPH自由基清除率;B.·OH自由基清除率;C.ABST+自由基消除率.圖1 Biflorin和Isobiflorin的體外自由基消除能力 Fig.1 Free radicals scavenging capacity of biflorin and isobiflorin in vitro

2.2 Biflorin和Isobiflorin對(duì)H2O2處理肝細(xì)胞的影響

L02細(xì)胞在不同濃度的過(guò)氧化氫溶液中處理4 h后，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度超過(guò)200 mmol·L-1時(shí)，L02細(xì)胞的存活受到顯著抑制(P<0.05)(圖2A).為了保證模型的穩(wěn)定性，后續(xù)選擇400 mmol·L-1的H2O2溶液構(gòu)建氧化損傷L02細(xì)胞模型；再以不同濃度的Biflorin和Isobiflorin溶液作用于L02細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Biflorin和Isobiflorin濃度為50、100和200 nmol·L-1時(shí)對(duì)肝細(xì)胞無(wú)明顯增殖抑制(P>0.05)(圖2B).因此，選擇50～200 nmol·L-1樣品濃度作用于H2O2誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞.

A.不同濃度H2O2對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響;B.不同濃度Biflorin和Isobiflori對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響;C.Biflorin和Isobiflorin對(duì)H2O2處理L02細(xì)胞ROS消除率的影響;D.Biflorin和Isobiflorin對(duì)H2O2處理L02細(xì)胞存活率的影響.與空白組相對(duì)比，##P<0.01；與模型組相對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01.圖2 Biflorin和Isobiflorin對(duì)H2O2處理肝細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of biflorin and isobiflorin on H2O2-damaged hepatocyte

用Biflorin和Isobiflorin分別處理H2O2誘導(dǎo)的LO2肝細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著B(niǎo)iflorin和Isobiflorin濃度的增大，H2O2處理后L02細(xì)胞內(nèi)ROS消除率逐漸增大，同時(shí)給藥組細(xì)胞的存活率相較于模型組呈逐漸上升的趨勢(shì)(P<0.05)(圖2D).由此推測(cè)Biflorin和Isobiflorin可降低H2O2對(duì)肝細(xì)胞的氧化損傷程度，從而提高肝細(xì)胞的生存率.

2.3 Biflorin和Isobiflorin對(duì)Nrf2信號(hào)通路主要因子表達(dá)水平的影響

以不同濃度Biflorin和Isobiflorin藥液樣品分別預(yù)處理L02細(xì)胞20 h，以H2O2處理細(xì)胞4 h，然后提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè).結(jié)果顯示，相較于空白組，模型組胞漿Nrf2蛋白含量大幅度降低，而核內(nèi)Nrf2蛋白大幅度提升，模型組的HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；隨著B(niǎo)iflorin和Isobiflorin的濃度的增大，胞漿Nrf2蛋白含量逐漸上升，而核內(nèi)Nrf2含量下降，并且L02細(xì)胞中的HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)水平也逐漸上調(diào)(圖3).

胞漿內(nèi)的蛋白以β-actin為內(nèi)參照抗體，核內(nèi)的蛋白以COX-4為內(nèi)參照抗體.圖3 Biflorin和Isobiflorin對(duì)H2O2處理肝細(xì)胞的Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of biflorin and isobiflorin on the expressions of Nrf2, HO-1 and NQO-1 proteins in H2O2-damaged hepatocyte

同時(shí)，以Biflorin和Isobiflorin預(yù)給藥20 h，再以H2O2繼續(xù)處理L02細(xì)胞4 h后，對(duì)提取的L02細(xì)胞總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)qRT-PCR測(cè)定基因表達(dá)量.結(jié)果表明，各組細(xì)胞中Nrf2 的mRNA表達(dá)水平均無(wú)明顯的波動(dòng)(P>0.05)，但相比于空白組的細(xì)胞，模型組的HO-1和NQO-1的mRNA表達(dá)水平明顯降低，而隨著B(niǎo)iflorin和Isobiflorin濃度的增大，L02細(xì)胞中HO-1和NQO-1的mRNA表達(dá)水平逐漸提高(圖4).

與空白組相對(duì)比時(shí)，##P<0.01；與模型組相對(duì)比時(shí)，*P<0.05，**P<0.01.圖4 Biflorin和Isobiflorin對(duì)過(guò)氧化氫損傷L02細(xì)胞的Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of biflorin and isobiflorin on mRNA expressions of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in H2O2-damaged hepatocyte

由上述試驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)，Biflorin和Isobiflorin可促進(jìn)H2O2損傷的肝細(xì)胞內(nèi)Nrf2基因進(jìn)行核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而調(diào)節(jié)抗氧化基因HO-1和NQO-1的mRNA和蛋白表達(dá).

4 討論

色原酮化合物屬于多酚類(lèi)化合物，相關(guān)報(bào)道提示其較強(qiáng)的抗氧化能力.唐小涵等[16]從望江南中分離出兩種色原酮，并通過(guò)DPPH法檢驗(yàn)出其具有一定抗氧化能力.本研究建立DPPH、ABTS和·OH自由基清除能力評(píng)價(jià)體系，結(jié)果表明Biflorin和Isobiflorin對(duì)DPPH、·OH和ABTS+自由基的半數(shù)消除率相似，與陽(yáng)性參照藥物維生素C對(duì)DPPH和ABTS+自由基的消除能力相當(dāng)，顯示了這兩種化合物良好的體外抗氧化活性，與上述結(jié)論一致.H2O2可造成機(jī)體自由基產(chǎn)生和清除的失衡，使得ROS在體內(nèi)大量堆積，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等被ROS氧化損傷，因此ROS含量可反映細(xì)胞的氧化受損程度[17].本研究通過(guò)H2O2誘導(dǎo)建立細(xì)胞氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)隨著B(niǎo)iflorin和Isobiflorin濃度的升高，L02細(xì)胞內(nèi)的ROS消除率增大，且其存活率逐漸提高.

在一般的生理?xiàng)l件中，Nrf2與Keap抗原重組蛋白牢固結(jié)合并固定于細(xì)胞質(zhì)溶膠中，主要作用于蛋白酶體的降解；在存在ROS等外界有害刺激的情況下，Nrf2從Keap1上釋放，發(fā)生轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)過(guò)程元件ARE結(jié)合而激活下游HO-1、NQO-1等抗氧化物基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)的氧化還原體系趨于平衡[18]. HO-1是一類(lèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，它通過(guò)促進(jìn)血紅素分解而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物膽綠素，對(duì)ROS有著顯著的消除作用[19]，而NQO1能夠促進(jìn)醌的排泄，從而抑制ROS的產(chǎn)生[20].孫濤等[21]發(fā)現(xiàn)在隨著細(xì)胞內(nèi)活性氧的減少與Nrf2、NQO1和HO-1基因和蛋白的表達(dá)上調(diào).本研究利用RTq-PCR和Western blot測(cè)定Nrf2等抗氧化信號(hào)通道中關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Biflorin和Isobiflorin可通過(guò)促進(jìn)Nrf2蛋白的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游抗氧化基因NQO1和HO-1基因和蛋白的表達(dá)，從而抑制L02細(xì)胞氧化損傷并提高細(xì)胞的存活率.