中華蜜蜂磁響應(yīng)基因MagR、Cry2的克隆和時空表達(dá)

李英嬌, 周 賀, 陳藝杰, 李江紅

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(福建)蜜蜂生物學(xué)觀測站，福建 福州 350011)

蜜蜂是自然生態(tài)鏈中不可或缺的重要一環(huán).在蜜蜂的生活環(huán)境中，它們不得不面對許多包括磁場、殺蟲劑、疾病、天敵、氣候變化等諸多脅迫因子影響.研究表明[1-7]，磁場影響著蜜蜂的行為、生理和生長發(fā)育等方面.蜜蜂體內(nèi)有磁感應(yīng)受體，但其作用機(jī)制還不明確.生物對磁場感知的關(guān)鍵在于“磁受體”的確定，目前主要有兩種假說得到了廣泛認(rèn)可，即基于磁鐵礦顆粒(Fe3O4)的磁受體假說和依賴于隱花色素的化學(xué)自由基對假說.前者認(rèn)為，生物可借助體內(nèi)的磁鐵礦顆粒(Fe3O4)感受磁場[8].目前得到公認(rèn)的、最有可能存在該類磁受體部位有鳥的上喙和內(nèi)耳、魚的鼻組織以及昆蟲的腹部.其中蜜蜂前腹的背側(cè)區(qū)被認(rèn)為是磁受體可能存在的解剖位點(diǎn)之一[9].而后者則認(rèn)為生物體內(nèi)的隱花色素(cryptochrome, Cry)是理想的磁受體，Cry在藍(lán)光/近紫外光等光刺激下容易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生自由基對(2個不成對電子)，這個自由基對的自旋狀態(tài)能夠受磁場影響，在單重態(tài)和三重態(tài)之間快速轉(zhuǎn)換，從而引發(fā)下游的神經(jīng)信號傳導(dǎo)，使生物在第一時間感受到變化的磁場信息，指導(dǎo)動物精確定位、定向[10-11].

實(shí)際上，基于磁鐵礦顆粒和隱花色素的兩種磁感應(yīng)機(jī)制之間并不沖突，少數(shù)生物的磁感應(yīng)僅涉及其中一種，而大多數(shù)則是兩者兼具，互為補(bǔ)充；兩種磁受體同時感應(yīng)磁場，同時將來自太陽、星空和地標(biāo)等視覺信息進(jìn)行整合，使生物辨別方向的準(zhǔn)確率顯著提高.此外，另一種潛在的磁受體，即MagR(Magnetoreceptor)，原名IscA，屬于鐵硫簇結(jié)合蛋白(簡稱鐵硫蛋白)[12]，該蛋白由Jacobson et al[13]首次在棕色固氮菌中發(fā)現(xiàn)，命名為ORF6.隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，經(jīng)過PCR測序等手段進(jìn)行驗(yàn)證后，將ORF6改名為IscA[14].之后，Long et al[15]研究表明，將IscA1導(dǎo)入到HEK-293細(xì)胞及秀麗隱桿線蟲中，發(fā)現(xiàn)外加磁場會改變細(xì)胞的動作電位和線蟲的運(yùn)動，并將IscA命名為MAR.也有研究人員在果蠅全基因組中篩選到全新的磁受體蛋白，并最終將其命名為MagR[16].MagR蛋白是線粒體內(nèi)一類重要的功能蛋白，不僅自身能夠感應(yīng)磁場，也能與Cry相互作用形成光磁耦合的磁場感應(yīng)復(fù)合物.在大腸桿菌、帝王蝶、鴿子和人等多種生物中均已證實(shí)MagR能與Cry在體外形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物[16].目前MagR基因在果蠅、粘蟲、褐飛虱等昆蟲上均有報道，而在蜜蜂領(lǐng)域的研究較少.隱花色素Cry對藍(lán)光、近紫外光較敏感，在長期進(jìn)化過程中，Cry產(chǎn)生了兩大基因家族，即Cry1和Cry2，果蠅體內(nèi)只有Cry1，而蜜蜂體內(nèi)只有Cry2[17].目前在果蠅、褐飛虱等昆蟲上有較多關(guān)于Cry的報道[16,18-22]，而在蜜蜂領(lǐng)域的研究較少.趙方媛等[23]成功克隆了西方蜜蜂MagR基因序列，但MagR基因是否通過編碼的蛋白作為磁受體在蜜蜂的定位導(dǎo)航中發(fā)揮作用，目前尚不清楚.另外，MagR和Cry2蛋白能夠形成復(fù)合體，其蛋白結(jié)構(gòu)具有特殊的結(jié)構(gòu)域使兩者有機(jī)地結(jié)合在一起[16].因此，本試驗(yàn)通過對中蜂磁響應(yīng)基因AcMagR和AcCry2進(jìn)行克隆和測序，分析相關(guān)基因序列信息，對編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測，利用qPCR技術(shù)對這兩個基因在工蜂不同日齡、不同組織中的表達(dá)特征進(jìn)行分析，以期為磁響應(yīng)基因MagR和Cry2的功能及磁感應(yīng)機(jī)理研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 中華蜜蜂樣本來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(福建)蜜蜂生物學(xué)觀測站內(nèi)自養(yǎng)蜂群.基因克隆樣本：在蜂箱內(nèi)隨機(jī)抓取10只工蜂，液氮速凍后置于-80 ℃儲存?zhèn)溆?熒光定量PCR的樣本：選取6群群勢強(qiáng)壯、無自然分蜂傾向的中華蜜蜂健康蜂群，分別從蜂巢中抽出1～2張新蜂即將大量出房的封蓋子脾置于人工培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)(相對溫度34.5 ℃，相對濕度60% RH，避光培養(yǎng))，待其羽化出房后用油漆筆在背部進(jìn)行標(biāo)記，再放回原來的蜂群，分別在成蜂1、5、10、15、20、25、30日齡時進(jìn)行采樣.每個日齡均采90只，隨機(jī)分為3組，每組30只，并用鑷子取下各日齡工蜂的頭、胸、腹(去除消化系統(tǒng))，迅速投入液氮速凍后置于-80 ℃儲存?zhèn)溆?

1.1.2 試劑 Trizol RNA分離試劑，Ambion公司；氯仿，北京化工廠；酚，Coolaber公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒，Takara公司；熒光定量PCR試劑盒Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)，上海翊圣公司；膠回收試劑盒，AXYGEN公司；Primer Mix，天根生物科技有限公司.

1.1.3 儀器 高壓滅菌鍋(SS-325，日本TOMY公司)、Venticell 55升標(biāo)準(zhǔn)型干燥箱(MC000712，德國MMM公司)、低溫離心機(jī)(5424-R，德國Eppendoff公司)、移液槍(德國Eppendoff公司)、大型低溫離心機(jī)(Centrifuge 5145D，德國Eppendoff公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、超純水器(E1IX10，美國Millipore公司)、PCR 擴(kuò)增儀(PTC-200，Takara公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc2000，美國Bio-Rad公司)、超低溫冰箱(FORMA，美國Thermo Electron公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex，美國ABI公司).

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA與合成cDNA 用研磨器對不同日齡、不同組織的工蜂樣品充分研磨，參照 RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測量總RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，以1 μg總RNA量反轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA 鏈，存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與目的基因克隆 以前期實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組結(jié)果為基礎(chǔ)，引物使用Primer Premier 6.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物合成委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司完成(表1).按照陳藝杰等[24]的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，MagR和Cry2退火溫度分別設(shè)定58、55 ℃.電泳檢測并于紫外燈下切取目的條帶回收純化，用pGM-T載體連接過夜，轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，平板培養(yǎng)過夜.最后，挑取單克隆菌落PCR鑒定為陽性后擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液送福州博尚生物技術(shù)有限公司測序.

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.3 基因的序列分析 采用NCBI BlastP同源性分析；利用ORF Finder軟件獲得該序列的編碼區(qū)域；SMART分析功能結(jié)構(gòu)域；使用MEGA 6.0軟件鄰位相連法(Neighbor-joining)進(jìn)行1 000次重復(fù)計(jì)算后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，MagR、Cry蛋白序列來源見表2.

表2 中蜂與其他昆蟲MagR、Cry蛋白序列來源Table 2 Sequence information of MagR and Cry proteins used in phylogenetic analysis

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng) 以β-actin作為參照基因，熒光定量PCR反應(yīng)體系(10 μL)：SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.25 μL，cDNA模板0.5 μL，DEPC水4 μL.反應(yīng)條件：UDG激活50 ℃ 2 min，預(yù)變性95 ℃ 3 min；PCR擴(kuò)增(40個循壞)95 ℃ 30 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 45 s；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s.定量分析設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù).

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 根據(jù)熒光定量PCR得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光曲線的Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分別采用SPSS 21.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)和t-檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析.所得結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，并利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖形分析.P<0.05 作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因克隆

利用設(shè)計(jì)的引物，以中華蜜蜂cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，得到與預(yù)期長度一致的目的片段，AcMagR和AcCry2分別約為500、1 700 bp(圖1).

圖1 AcMagR和Accry2基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of AcMagR and Accry2 genes

2.2 序列分析

利用NCBI BlastP分析測序所得的序列同源性，將目的基因分別命名為AcMagR和AcCry2，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得的登錄號分別為：MZ054257、MZ054258.利用ORF Finder對所獲得的序列分析表明，2個目的基因的完整開放閱讀框(ORF)分別為393、1 713 bp，分別編碼130、570個氨基酸.氨基酸序列中分別含有4和13個保守的半胱氨酸位點(diǎn)，AcMagR蛋白具有Fe-S_biosyn功能結(jié)構(gòu)域，位于第24～126位氨基酸之間.AcCry2蛋白具有2個功能結(jié)構(gòu)域(DNA_photolyase和FAD_binding_7)，分別位于第23～189、303～503位氨基酸之間.

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將克隆所得核酸序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp分析，找到與目的基因(AcMagR和AcCry2)有同源性的昆蟲氨基酸序列，用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2).結(jié)果表明，中華蜜蜂MagR基因與西方蜜蜂親緣關(guān)系最近，與大蜜蜂、小蜜蜂、黑大蜜蜂、歐洲熊蜂等親緣關(guān)系較近，與北方皺切葉蟻、紅收獲蟻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與西花薊馬、黑腹果蠅、銅綠蠅、絲光綠蠅親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；而中華蜜蜂Cry2基因與西方蜜蜂的親緣關(guān)系最近，與大蜜蜂、小蜜蜂、歐洲熊蜂等親緣關(guān)系較近，與佛羅里達(dá)弓背蟻、北方皺切葉蟻、紅收獲蟻等親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

A:MagR；B：Cry2.圖2 基于MagR和Cry2蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by MagR and Cry2 proteins

2.4 AcMagR和AcCry2基因表達(dá)分析

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，在同日齡工蜂中，胸部AcMagR基因的表達(dá)量顯著高于頭部和腹部，頭部和腹部之間差異不顯著，AcMagR基因在20日齡后的工蜂體內(nèi)表達(dá)量顯著高于前期日齡工蜂，胸部AcCry2的表達(dá)量也顯著高于頭部和腹部，頭部和腹部兩者比較差異不顯著，但AcCry2基因在所有日齡工蜂體內(nèi)表達(dá)量均較高(圖3).

A:AcMagR；B：AcCry2.柱上不同的小寫字母代表同一日齡不同組織的表達(dá)量差異顯著.圖3 中蜂不同日齡工蜂頭部、胸部和腹部中AcMagR、AcCry2的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of AcMagR and AcCry2 in head, thorax and abdomen of A.cerana workers bee at different ages

3 結(jié)論

本試驗(yàn)獲得中蜂AcMagR、AcCry2基因序列，分別含有長為393、1 713 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼130、570個氨基酸.系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，中華蜜蜂的MagR基因與西方蜜蜂親緣關(guān)系最近，與大蜜蜂、小蜜蜂、黑大蜜蜂等親緣關(guān)系較近，而與果蠅、綠蠅等其他昆蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與這些昆蟲之間的親緣關(guān)系基本一致.MagR蛋白具有多個鐵硫簇結(jié)合位點(diǎn)，而鐵硫簇是形成磁感應(yīng)復(fù)合體magnetoreceptor的關(guān)鍵物質(zhì)，說明MagR可能與磁感應(yīng)有關(guān)[25].已有研究證明[26]，在果蠅中MagR蛋白聚合形成棍狀的形似指南針的結(jié)構(gòu)，能夠感受外界磁場的變化；AcCry2蛋白具有DNA光解酶結(jié)構(gòu)域(DNA_photolyase)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD_binding_7)結(jié)合區(qū)域，這兩個結(jié)構(gòu)域均屬于Cry蛋白的發(fā)色團(tuán)，在光信號接收和傳導(dǎo)方面是重要功能元件，說明Cry2需要結(jié)合在DNA上發(fā)揮作用，光誘導(dǎo)的Cry蛋白的FAD-色氨酸自由基對具有磁敏感特征，可以感應(yīng)地磁場.這說明AcMagR、AcCry2基因可能在蜜蜂的磁場感受中發(fā)揮重要作用.

AcMagR基因在胸部的表達(dá)量顯著高于頭部和腹部，與趙方媛等[23]在西方蜜蜂試驗(yàn)中所得結(jié)果一致.胸部是蜜蜂的運(yùn)動中心，在蜜蜂飛行過程中起著至關(guān)重要的作用.在正常蜂群中，出房1周后的成年工蜂，主要從事巢內(nèi)相關(guān)哺育任務(wù)(哺育蜂)，1～2周后，它們則從事巢內(nèi)清理、保衛(wèi)或儲蜜釀蜜等工作，出房3周以后開始外出從事采粉采蜜等工作(采集蜂)[27].研究表明[4,28-30]，在外磁場干擾下，采集蜂容易受到影響，如舞蹈行為、定向能力易受干擾，返巢數(shù)減少，學(xué)習(xí)能力、記憶力下降，導(dǎo)致飛行和覓食行為均受影響，進(jìn)而降低授粉能力.因此，AcMagR基因在20日齡后采集蜂胸部高表達(dá)，可能與蜜蜂外出采集、返巢過程中的定位有關(guān)系；AcCry2基因在不同日齡工蜂的胸部表達(dá)量高于頭部和腹部，高表達(dá)部位上與黏蟲、鴿子等一致[16,31].AcMagR和AcCry2共同高表達(dá)于采集蜂的胸部，這為蜜蜂形成類似于果蠅體內(nèi)的棒狀磁感應(yīng)復(fù)合體提供了基礎(chǔ)，暗示它們在工蜂定位、歸巢中發(fā)揮重要作用[16].由于MagR和Cry2基因及其蛋白在蜜蜂領(lǐng)域的研究較少，從基因?qū)用鎸γ鄯涠ㄏ驒C(jī)制的研究存在一定的局限性，不能完全確定MagR和Cry2基因在蜜蜂體內(nèi)的具體功能，未來還需要研究蜜蜂行為學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、蛋白組學(xué)等，以解開蜜蜂的磁感應(yīng)之謎.