花生對非繁殖期雌性黑線倉鼠細胞免疫和血液指標的影響

于祎 趙明星 王玉輝 張學英 徐德立* 王德華,3*

（1 曲阜師范大學生命科學學院，曲阜 273165）（2 中國科學院動物研究所，農業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，北京 100101）（3 山東大學生命科學學院，青島 266237）

免疫系統(tǒng)能防御環(huán)境中病原體如病毒、細菌、真菌等對動物的攻擊，對動物的生存發(fā)揮重要作用，是適合度的重要組分(Sheldon and Verhulst, 1996；徐德立和王德華，2012)。動物的免疫能力受多種因素如季節(jié)(張志強和王德華，2006;Xuet al.,2018；徐德立等，2021)、光周期(Nelson and Demas,1996)、溫度(Xuet al.,2017)、食物(Xu and Wang,2010,2011)等的影響，其中食物的數量和質量是影響動物免疫功能的重要因素之一(陳競峰等，2007；徐德立和王德華，2015)。

營養(yǎng)不良會損害人和動物的免疫能力,這可能是由于能量和(或)營養(yǎng)成分攝入不足引起(Calder and Kew, 2002; Kaminogawa and Nanno, 2004)，例如能量缺乏如禁食(Lordet al., 1998; Nakamuraet al., 2001, 2004) 或限食(Demas and Nelson, 1998;Bilbo and Nelson, 2004；徐德立和徐來祥，2015)都會抑制動物的免疫功能。同樣營養(yǎng)過剩和(或)能量攝入過多會抑制免疫能力(Calder and Kew,2002;Amaret al., 2007)，例如高脂和(或) 高糖食物會抑制大鼠的天然免疫和體液免疫(陳軼楠等，2020；葛林等，2020；徐肖元等，2020)。有關食物質量對野生動物免疫功能影響的研究較少，例如高蛋白食物不影響長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)胸腺、脾臟濕重以及體液免疫能力(陳競峰等，2007)。因此，有必要在更多野生物種中開展食物質量或種類在其免疫功能中作用的研究，以深化對動物食物選擇生理機制的認識。

植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin, PHA)反應常用來評估哺乳動物的細胞免疫能力，主要負責控制細胞內病原體(de Bellocqet al., 2006;Zhang and Zhao, 2015)。血液中細胞種類、數量和成分的變化可用來檢測動物的免疫功能和健康狀況(張志強，2015;Xuet al.,2017)，例如白細胞和淋巴細胞能直接參與機體的免疫反應，可指示動物的健康狀況(Calder and Kew, 2002; Xu and Hu,2020)，紅細胞、血紅蛋白濃度和紅細胞壓積能反映動物的輸氧能力(Harikrishnanet al., 2011; Kim and Kang,2016;Fazioet al.,2016)。

黑線倉鼠(Cricetulus barabensis) 主要分布于中國北方，在蒙古國、俄羅斯和朝鮮也有分布(張知彬和王祖望，1998)，食性雜，獨居，不冬眠，具有貯食行為(趙志軍，2012; Zhaoet al., 2014)。黑線倉鼠的天然免疫、細胞和體液免疫能力與血液指標均存在季節(jié)變化(Xuet al., 2018; Xu and Hu, 2020；徐德立等，2021)，并且與季節(jié)相關的光周期、溫度和食物數量均會影響其免疫功能(徐德立和徐來祥，2015; Xuet al., 2017; Xu and Hu,2017)，而不同繁殖狀態(tài)包括非繁殖期、妊娠期、哺乳期和斷乳期的雌性黑線倉鼠，其細胞免疫能力無差異(張志強等，2015)。食物的種類和數量會隨季節(jié)而變化，秋季黑線倉鼠常以農田里的花生為食，這是因為該物種對食物的選擇偏好明顯，尤其喜食花生(王淑卿等，1992；楊玉平等，2002)。作為黑線倉鼠的喜食食物，除了適口性和味道外，是否有其他因素影響其食物選擇？在野外條件下，黑線倉鼠是否會優(yōu)先選擇有利于自身健康的食物？為探討這一問題，我們用花生飼喂黑線倉鼠，然后檢測反映健康狀況的免疫學指標和血液指標，并預測飼喂花生會增強黑線倉鼠的免疫能力。

1 研究方法

1.1 實驗設計

實驗動物為野生非繁殖期雌性黑線倉鼠，秋季捕獲于山東省曲阜市九仙山，單籠(30 cm ×15 cm×20 cm)飼養(yǎng)于光周期為12 L∶12 D、溫度為(21±1)℃的環(huán)境，自由取食和飲水，飼養(yǎng)大約2個月后體重穩(wěn)定，將30只雌鼠隨機分為正常飼料組(normal fodder group,NF,n=10)、花生加飼料組(normal fodder plus peanuts group,NP,n=10)和花生組(Peanut,n=10)。正常飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)主要含有粗脂肪4.0%、粗蛋白18.0%、粗纖維5.0%、水分10.0%、氨基酸7.7%、維生素0.01%、金屬離子4.0%，能值為14.4 kJ/g；花生主要含有脂肪44.3%、蛋白質24.8%、碳水化合物21.7%、粗纖維5.5%、水分9.0%、氨基酸7.1%、維生素3.9%、金屬離子1.3%、多不飽和脂肪酸16.3%，能值為24.03 kJ/g?；ㄉ语暳辖M為正常飼料和花生按1∶1(W∶W)比例投喂，處理時間為39 d。Day 0和Dayn分別代表處理第0天和第n天，每3 d于09:00—10:00測量體重和攝食量，電子天平精確度為0.1 g，每只動物每3 d投喂30 g食物，每日攝食量為(30 g-3 d后剩余食物)/3。

1.2 細胞免疫功能的測定

將植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin，PHA)注射到動物足墊中部，可誘導T 淋巴細胞的增殖反應并引起足墊腫脹，腫脹程度越大，即PHA反應越大，表明T細胞增殖能力越強，因此，PHA反應可反映哺乳動物細胞免疫功能(de Bellocqet al., 2006; Xu and Wang, 2010)。在Day 35，用數顯電子測微尺(Mitutoyo Absolute cod. 547-301,日本) 測量3 組黑線倉鼠左后足足墊的厚度(精確至± 0.01 mm)，后用75%的酒精對左后足足墊進行消毒，在足墊中心處注射30 μL 含0.1 mg PHA(PHA-P,Sigma L-8754)的無菌PBS緩沖液(pH值7.4)，分別在6 h、12 h、24 h和48 h 后測量左后足足墊厚度，每只動物測量6次，平均值即為足墊厚度，為減少誤差，測量時由同一個人操作。PHA反應=(注射后足墊厚度-注射前足墊厚度)/注射前足墊厚度(Xu and Wang,2010;Xu and Hu,2017)。

1.3 血液指標

血液指標同樣能反映動物的健康狀況(Harikrishnanet al., 2011; Fazioet al., 2016; Kim and Kang,2016;Xu and Hu,2020)。在Day 34 用異氟烷(山東利諾制藥有限公司) 輕度麻醉，眼眶后竇取血(約100 μL)，迅速取20 μL 血液，用4 mL 血細胞分析稀釋液(含氯化鈉、硫酸鈉、緩沖劑、抗菌劑、防腐劑) 進行稀釋，全自動血液細胞分析儀(DYMIND UN73) 檢測紅細胞數、血紅蛋白濃度、白細胞數、淋巴細胞數、血小板數等血液指標(Xuet al.,2018;Xu and Hu,2020)。

1.4 統(tǒng)計分析方法

用SPSS 18.0軟件包對所有數據進行統(tǒng)計分析，數據分析前，用Kolmogorov-Smirnov進行正態(tài)性檢驗，所有數據均符合正態(tài)分布。PHA反應用反正弦轉化后進行分析，采用重復測量(Repeated measures)的方差方法分析體重、攝食量和PHA反應的時間變化及組間差異，每個時間點的體重、攝食量、PHA 反應以及所有血液指標均采用單因素方差(One-way ANOVA)和Tukey’s post hoc 檢驗進行分析，利用皮爾遜相關分析(Pearson correlation analysis)檢測PHA反應與血液指標之間的相關關系。統(tǒng)計結果用平均值±標準誤(mean±SE)表示，其中P＜0.05表示統(tǒng)計學差異顯著，P＜0.01表示統(tǒng)計學差異極顯著，P＜0.001表示統(tǒng)計學差異極其顯著。

2 結果

2.1 體重

實驗開始前，NP、NF 和Peanut 組黑線倉鼠的體重沒有顯著差異(Day 0:F2，27= 0.005,P=0.995)，但 在Day 15 (F2，27= 3.437,P= 0.047)、Day 18 (F2，27= 4.529,P= 0.020)、Day 24 (F2，27=3.547,P= 0.043)、Day 27 (F2，27= 3.546,P=0.043) 和Day 30 (F2，27= 4.246,P= 0.025) 的體重組間差異顯著，其他時間點則沒有顯著差異(圖1)。

圖1 飼喂花生對雌性黑線倉鼠體重的影響. NF：正常飼料組；NP：花生加飼料組；Peanut：花生組. *表示組間差異顯著Fig. 1 Effect of feeding peanut on body mass in female striped hamsters. NF: normal fodder group; NP: normal fodder plus peanuts group; Peanut: peanut group. * indicates significant differences between groups

2.2 攝食量

黑線倉鼠攝食量在Day 3 (F2，27= 0.579,P=0.567)和Day 39(F2，27=1.852,P=0.176)3組間沒有顯著性差異，但Peanut組和NP組的攝食量從Day 6 (F2，27= 13.436,P＜0.001) 至Day 36 (F2，27=11.108,P＜0.001)，均顯著低于NF組(圖2)。

圖2 飼喂花生對雌性黑線倉鼠攝食量的影響. NF：正常飼料組；NP：花生加飼料組；Peanut：花生組. **P ＜0.01，***P ＜0.001Fig. 2 Effect of feeding peanut on food intake in female striped hamsters. NF: normal fodder group; NP: normal fodder plus peanuts group;Peanut:peanut group. **P ＜0.01,***P ＜0.001

2.3 細胞免疫反應

PHA 反應隨注射PHA 溶液后的時間延長而降低(F1,27=472.636,P＜0.001)，但不受時間與分組之間交互作用的影響(F2,27= 1.307,P= 0.287)；NF 組(F1,9= 100.447,P＜0.001)、NP 組(F1,9=239.215,P＜0.001) 和Peanut 組(F1,9= 181.001,P＜0.001)最大PHA 反應為注射PHA 后6 h(圖3)。NP 組PHA 注 射 后12 h 高 于NF 組(F2,27= 3.372,P= 0.049)，而PHA 注射后6 h (F2,27= 1.379,P=0.269)、PHA 注射后24 h (F2,27= 1.782,P= 0.187)以及PHA注射后48 h(F2,27=0.373,P=0.692)在3組間均無顯著差異(圖3)。

圖3 飼喂花生對雌性黑線倉鼠PHA反應的影響. 柱子上方不同字母代表組間差異顯著. NF：正常飼料組；NP：花生加飼料組；Peanut：花生組Fig. 3 Effect of feeding peanut on PHA response in female striped hamsters. Different letters above the columns indicate significant differences at the level of P ＜0.05. NF: normal fodder group; NP: normal fodder plus peanuts group;Peanut:peanut group

2.4 血液指標

與NF組相比，NP組和Peanut組紅細胞(RBC)和紅細胞壓積(PCV) 顯著增加，Peanut 組的血小板(PLT)高于NF與NP組(表1)；白細胞(WBC)和淋巴細胞(LYMF) 在3 組間沒有顯著差異，但NP組 和Peanut 組WBC 比NF 組 分 別 高22.9% 和25.0%，LYMF 分別高15.0%和22.5% (表1)。其他血液指標包括紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞分布寬度(RDW)、血紅蛋白濃度(HGB)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC) 和淋巴細胞比率(LYMF%)在3 組之間均無顯著差異(表1)。相關性分析表明，PHA注射6 h與PLT數和LYMF%呈負相關，PHA 注射24 h 與LYMF%呈負相關，而PHA 注射12 h和24 h與RBC數和PCV呈正相關(表2)。

表1 飼喂花生對雌性黑線倉鼠血液指標的影響Table 1 Effect of feeding peanut on hematological indices in female striped hamsters

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3 討論

飼喂花生增加了黑線倉鼠的體重，但降低了攝食量，這可能與花生脂肪含量和能值比正常飼料高有關。許多研究發(fā)現，高脂食物能增加人和動物的體重(Conway and Rene, 2004; Lamaset al.,2004;Amaret al., 2007)，也有研究發(fā)現高脂食物不影響動物體重，但降低了攝食量(畢中強等，2018)。本研究的不足在于沒有區(qū)分花生加飼料組中黑線倉鼠攝入的花生與正常飼料的量，因而無法確定其能量攝入。

與預測一致，花生加飼料組注射PHA 12 h 反應顯著高于正常飼料組，而單純飼喂花生組與正常飼料組PHA 反應無差異，這些結果表明在正常飼料的基礎上添加飼喂花生能提高黑線倉鼠的細胞免疫能力，這可能與花生含有豐富的維生素、必需氨基酸、必需脂肪酸以及多種微量元素等有關(李立等，2013；張慧文等，2015；劉寶軍等，2019)。食物中的營養(yǎng)成分是影響人和動物免疫能力的重要因素，營養(yǎng)不良會損害免疫系統(tǒng)，從而導致宿主感染風險增加，這可能是由于能量攝入和食物營養(yǎng)成分(包括糖、脂肪和蛋白質) 以及某些特定的微量營養(yǎng)成分攝入不足引起(Calder and Kew, 2002; Kaminogawa and Nanno, 2004; Westerterp-Plantengaet al., 2012)。例如禁食會抑制實驗室小鼠和大鼠(Lordet al., 1998; Nakamuraet al.,2001, 2004) 以及野生長爪沙鼠(Xu and Wang,2010；徐德立和王德華，2015) 的細胞免疫能力，限食同樣會抑制動物如黑線倉鼠的體液免疫(徐德立和徐來祥，2015)、拉布拉多白足鼠(Peromyscus maniculatus) (Demas and Nelson, 1998) 和黑線毛足鼠(Phodopus sungorus) (Bilbo and Nelson, 2004) 的細胞免疫能力。許多研究發(fā)現營養(yǎng)成分包括必需氨基酸、必需脂肪酸、維生素(Vitamin,V)(如VA、VB6、VC和VE) 和微量元素(如Zn、Cu、Fe 和Se)對于維持免疫系統(tǒng)的正常功能至關重要(Calder and Kew, 2002; Kaminogawa and Nanno, 2004)。VE可通過抗氧化和清除自由基的作用增強免疫功能，例如衰老小鼠食物中添加VE后細胞免疫功能增加(Meydaniet al.,1986;Meydaniet al.,1997)，Zn 缺乏會損害多種免疫反應(Fraker and King, 1998)，而補充Zn 能增強小鼠的細胞免疫能力(Shankar and Prasad, 1998)。本研究中，單獨飼喂花生組與正常飼料組的細胞免疫功能沒有差異，與正常飼料相比，花生含有較多的脂肪、蛋白質以及維生素，這一結果表明不同營養(yǎng)成分按不同比例混合的食物可能對免疫反應的作用相似。綜上可見，多種營養(yǎng)成分均會影響動物的免疫能力，但究竟花生中的哪些營養(yǎng)成分或者不同營養(yǎng)成分按什么比例混合增加了黑線倉鼠的細胞免疫能力，還需要進一步的研究。

與預測不同的是，WBC、LYMF 和LYMF%在正常飼料組、花生加飼料組和花生組之間差異不顯著，但花生加飼料組和花生組WBC 比正常飼料組分別高22.9%和25.0%，LYMF分別高15.0%和22.5%，這些結果暗示飼喂花生可能促進了白細胞以及淋巴細胞的增殖。注射PHA 6 h、PHA 12 h、PHA 24 h、PHA 48 h 與血液中WBC 以及LYMF不存在相關性，但LYMF%與注射PHA 6 h和PHA 24 h呈顯著負相關，這些結果表明在黑線倉鼠左后足足墊中心部位注射PHA 溶液后，作為抗原，PHA一方面可能刺激了T淋巴細胞的增殖反應，另一方面也可能會誘導血液中的淋巴細胞遷移到PHA 注射部位，從而導致足墊腫脹。Zhang 和Zhao(2015)的研究發(fā)現黑線倉鼠左后足足墊中心部位注射PHA 發(fā)生的腫脹反應主要與T 淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞增殖或聚集有關。

花生加飼料組和花生組的RBC 和PCV 均高于正常飼料組，表明飼喂花生增加了黑線倉鼠運輸氧氣的能力，這可能是因為花生比正常飼料含有更高蛋白質、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分(孫中瑞和封海勝，1986；劉麗娜等，2009)，它們可能更有利于紅細胞的產生。此外，注射PHA 12 h 與RBC 和PCV 呈正相關，暗示動物具有較強輸氧能力，可能有助于提高其細胞免疫功能。Peanut 組PLT顯著高于NF組和NP組，表明花生具有增強凝血的作用，這可能與攝入的花生種皮有關。許多研究發(fā)現，花生種皮能增加血小板數目(劉寶軍等，2019；高雅婷和張永軍，2020)?；ㄉN皮中含有白藜蘆醇、單寧酸、原花色素等成分(Udenigweet al., 2008)，至于哪種成分促進了血小板增殖，還需要進一步的研究。

總之，飼喂花生增加了黑線倉鼠的體重，但其攝食量降低。正常飼料中添加花生能增強黑線倉鼠的細胞免疫功能，暗示其清除細胞內病原體的能力可能增加。飼喂花生增加了黑線倉鼠RBC和PCV，表明花生具有增強動物輸氧能力的作用。雖然飼喂花生不影響黑線倉鼠WBC 和LYMF，但花生加飼料組和花生組的WBC 和LYMF 比正常飼料組高，暗示花生可能具有促進WBC 和LYMF 增殖的作用?；ㄉMPLT高于正常飼料組，說明花生可能具有增強凝血的作用。以上這些結果表明，飼喂花生能提高黑線倉鼠的健康水平?？梢?，在選擇食物時，除適口性和味道外，黑線倉鼠會選擇有利于健康的食物——花生，由于花生營養(yǎng)成分復雜多樣，至于哪種營養(yǎng)成分能增加免疫功能，還需要深入研究。