半乳甘露聚糖檢測(cè)在圈養(yǎng)海洋動(dòng)物曲霉病早期診斷的應(yīng)用

董貴信 張德錄 黃澤林 張孝敏梁淑余 陳小芬 沈博 張鵬

（1 廣東長隆集團(tuán)有限公司，廣州 511400）（2 珠海長隆海洋王國，珠海 519000）（3 廣東華南珍稀野生動(dòng)物物種保護(hù)中心，珠海519031)

曲霉菌是廣泛存在于自然界的一種腐生菌。由于曲霉菌孢子較小，在空氣中漂浮，一般是通過呼吸道進(jìn)入機(jī)體感染后引起曲霉病，為條件性致病菌(劉正印和王愛夏，2007)。曲霉病在人類、家畜和許多野生物種中都有發(fā)現(xiàn)，引起從局部感染到致命以及對(duì)吸入孢子的過敏反應(yīng)。曲霉病會(huì)引起海扇珊瑚致命性感染、蜜蜂僵化、鳥類肺部和氣囊感染、牛真菌流產(chǎn)和乳腺感染、馬喉囊真菌病、犬和貓的鼻竇感染，以及海洋哺乳動(dòng)物和非人靈長類動(dòng)物的侵入性肺部和大腦感染(Seyedmousaviet al.,2015；Meloet al.,2020)。在圈養(yǎng)條件下，海洋動(dòng)物很容易接觸到曲霉菌。在曲霉菌數(shù)量較少的情況下，個(gè)體如果能夠很好地適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境和群體生活，就可以保持健康不發(fā)病。曲霉病通常發(fā)生在那些不適應(yīng)環(huán)境和身體虛弱的動(dòng)物上。目前已從十余種海洋動(dòng)物中分離出曲霉菌(Gulland,2018;Itohet al.,2020)，曲霉病如果在發(fā)病后期才得到診斷，那么療程長而且往往預(yù)后不良(Schneideret al., 2014; Gulland, 2018)。在臨床獸醫(yī)學(xué)上，傳統(tǒng)的診斷手段(病理組織學(xué)、病原學(xué)培養(yǎng)等)對(duì)曲霉病的迅速診斷并指導(dǎo)臨床治療作用十分有限，易誤診誤治，疾病預(yù)后極差，因此曲霉病診治工作亟待進(jìn)一步規(guī)范，正確的針對(duì)圈養(yǎng)海洋動(dòng)物曲霉菌感染早期的檢測(cè)方法，對(duì)及時(shí)治療曲霉病具有重要意義(Marcio and Marr,2005；盧洪洲等，2018)。

曲霉菌檢測(cè)方法在人類醫(yī)學(xué)的研究較多，包括半乳甘露聚糖(Galactomannan, GM) 檢測(cè)、G 檢測(cè)(β-D-葡聚糖, β-D-glucan test) 以及實(shí)時(shí)PCR 等(Johanet al., 2002; Maertenset al., 2007；劉亞迪等，2014)。這3 種方法的靈敏度接近(分別為90.2%、87.5%和95.0%)，特異性也較為接近(分別為97.5%、89.6%和96.6%)，但在檢測(cè)成本費(fèi)用方面，GM 檢測(cè)明顯性價(jià)比更高(李世榮等，2010；傅中明等，2011)。GM 試驗(yàn)是臨床和檢驗(yàn)科室首要考量的檢測(cè)方法(中華內(nèi)科雜志編輯委員會(huì)，2007；葛偉等，2012)。GM 試驗(yàn)原理是當(dāng)曲霉菌侵入機(jī)體后，菌絲在組織中生長，其薄弱的菌絲頂端可釋放出GM 到血液和體液中，GM 釋放量與菌量成正比(王朝霞，2010；盧洪洲等，2018)?；诖嗽恚瑱z測(cè)血液和體液中的GM 含量，便可診斷曲霉菌。GM 檢測(cè)試劑盒由美國Bio-Rad公司研發(fā)，檢測(cè)半乳甘露聚糖抗原，結(jié)合無創(chuàng)傷手段和經(jīng)典的ELISA 方法，通過簡單操作流程，3 h 內(nèi)即可獲得結(jié)果，最主要的是半乳甘露聚糖抗原可在臨床發(fā)病前6 d 和診斷前10 d 即可檢出，真正實(shí)現(xiàn)早期診斷，為醫(yī)生提供啟動(dòng)治療的依據(jù)，避免因經(jīng)驗(yàn)治療而造成過量的抗真菌藥物毒性對(duì)患者的再次傷害，同時(shí)也節(jié)省了治療成本(Marret al., 2004; Mennink-Kemtenet al., 2004)。目前GM檢測(cè)已應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(趙蓓蕾等，2007；邢艷利，2011)，對(duì)海洋動(dòng)物還未見報(bào)道。

海洋動(dòng)物對(duì)曲霉菌易感，感染后期治療難度極大，預(yù)后不良，迫切需要找到一種對(duì)曲霉菌感染早期診斷的方法。本文旨在借鑒人類醫(yī)學(xué)的成熟技術(shù)，探索圈養(yǎng)海洋動(dòng)物曲霉菌感染早期的檢測(cè)方法。國內(nèi)水族館的海象(Odobenus rosmarus)、企鵝(Spheniscidae)等海洋動(dòng)物多數(shù)來源于寒冷干燥的地方，對(duì)曲霉菌敏感，當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境中曲霉菌數(shù)量較多時(shí)很容易被感染。盡管廣東珠海長隆海洋王國有比較完善的飼養(yǎng)設(shè)備設(shè)施，但是曲霉菌仍然對(duì)海洋動(dòng)物健康具有嚴(yán)重的威脅。2018年5—11 月，對(duì)珠海長隆海洋王國內(nèi)確認(rèn)或疑似患曲霉病的動(dòng)物采血送檢GM抗原，獲得診斷結(jié)果后對(duì)陽性個(gè)體展開抗真菌治療，同時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)GM 抗原，成功地治愈了包括海豚(Delphinidae)、海象在內(nèi)的曲霉菌早期感染病例。進(jìn)一步對(duì)企鵝、海獅(Otarriinae)、北極海雀(Alcidae)等動(dòng)物在體檢時(shí)專門篩查曲霉菌，查找無癥狀病例，結(jié)合其他血檢炎癥因子的對(duì)照和蛋白電泳，對(duì)無癥狀但是血項(xiàng)已經(jīng)改變、GM 抗原陽性的個(gè)體進(jìn)行抗真菌治療，至動(dòng)物GM抗原降低或陰性，其他血項(xiàng)炎癥因子也基本恢復(fù)正常。本研究通過GM檢測(cè)海洋動(dòng)物的曲霉菌感染情況，試圖找到海洋動(dòng)物曲霉病的早期診斷方法，對(duì)提高海洋動(dòng)物曲霉病的治愈率作出有意義的嘗試。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

長隆海洋王國是國內(nèi)最大的海洋動(dòng)物遷地保育機(jī)構(gòu)，位于廣東省珠海市橫琴新區(qū)(北緯22°09′，東經(jīng)113°53′)，地處珠江口西岸，瀕臨廣闊的南海，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，終年氣溫較高，年平均氣溫22.5℃，年平均相對(duì)濕度達(dá)80%，市區(qū)年平均降雨量為2 037 mm。常年降雨充沛，平均年降雨日130 ～150 d，冬春雨量少，夏秋雨量多，汛期雨量集中，曲霉菌容易聚集且繁殖快。

本研究對(duì)象為海洋哺乳動(dòng)物74 只，包括海豚31只、海象16只、海獅14只、白鯨(Delphinapterus leucas)13只；海鳥32只，包括企鵝28只，北極海雀4只，均為正在治療和常規(guī)體檢的動(dòng)物。海洋哺乳動(dòng)物收集血樣均是在良好的醫(yī)療行為馴化前提下，動(dòng)物自主配合采血；企鵝、海雀等鳥類的血樣收集方法是側(cè)臥保定，在展開的上側(cè)翅內(nèi)側(cè)選擇較粗較直的靜脈血管采血，在空腹情況下一次采血4 mL，在1 h 內(nèi)3 000 r/min 離心15 min，使血清在分離膠之上，然后取血清(至少1 mL)送至廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行GM抗原檢測(cè)。

1.2 GM檢測(cè)方法

采用ELISA 檢測(cè)血清GM。具體方法是取待測(cè)血 清30 μL，加 入100 μL 樣 品 處 理 液 混 勻，于100℃水溶3 min，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液備用，在96 孔板每孔中加入50 μL 結(jié)合液，50 μL 處理上清液，于37℃孵孕90 min，清洗后，在每孔加入375 μL 的清洗液，吸干后加入顯色液200 μL，于室溫下避光孵育30 min，加入終止液100 μL，在波長450 nm的酶表儀下讀數(shù)，檢測(cè)GM含量。按照試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。陰性對(duì)照組為健康動(dòng)物血清，陽性對(duì)照組為感染曲霉菌的動(dòng)物血清。

根據(jù)GM指數(shù)進(jìn)行GM實(shí)驗(yàn)陽性閾值的界定(盧婷等，2021)，計(jì)算公式：GM指數(shù)(I值)=待測(cè)樣本OD值／臨界值對(duì)照OD值均值。Bio-Rad公司的GM試劑盒商業(yè)化后得到廣泛應(yīng)用，但十余年來對(duì)于陽性閾值的界定仍存在不同意見(Marret al.,2004)。

本研究中，海洋動(dòng)物GM 值的檢測(cè)進(jìn)入初步研究階段，而且多數(shù)研究個(gè)體針對(duì)的是患病動(dòng)物和曲霉菌易感動(dòng)物，且為單次檢測(cè)，因此海洋動(dòng)物GM 閾值的設(shè)定還是未知數(shù)。本研究開始將海洋動(dòng)物的GM 指數(shù)≥0.5 作為陽性判斷的閾值，但是經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，一些海洋哺乳動(dòng)物的GM 指數(shù)達(dá)到0.62 時(shí)血項(xiàng)炎癥因子并未改變，臨床癥狀基本正常，尤其是一些海鳥，當(dāng)GM 指數(shù)達(dá)到1.15 時(shí)血項(xiàng)炎癥因子正常，臨床癥狀基本正常。經(jīng)過反復(fù)比較，包括各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)(GM 檢測(cè)結(jié)果、白細(xì)胞像、炎癥因子、蛋白電泳試驗(yàn)和肝功相關(guān)因子)綜合對(duì)比分析后，初步將海洋哺乳動(dòng)物的單次GM檢測(cè)指數(shù)≥0.7 作為陽性閾值，海鳥的單次GM 檢測(cè)指數(shù)≥1.2 作為陽性閾值。檢測(cè)的陽性個(gè)體比較符合曲霉菌感染早期的特征。為了檢測(cè)治療效果，有針對(duì)性地對(duì)GM 試驗(yàn)陽性個(gè)體(25 只有曲霉病特征的21 只陽性個(gè)體) 開展抗曲霉菌治療，方法是口服伏立康唑片(成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠，每片50 mg，海洋哺乳動(dòng)物3 mg/kg PO SID；海鳥5 mg/kg PO BID) 和特比萘芬片(齊魯制藥有限公司，每片125 mg，海洋哺乳動(dòng)物4 mg/kg PO SID；海鳥5 mg/kg PO SID)，檢測(cè)抗真菌治療前后GM 抗原水平的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)收集患病動(dòng)物的臨床資料，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究所得數(shù)據(jù)均采取SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件展開分析。治療前后結(jié)果采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示兩組數(shù)據(jù)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)以mean ± SD表示。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)本研究劃定的GM 檢測(cè)陽性閾值，31 只海豚中檢出10只陽性個(gè)體，陽性率為32.2%；16只海象中檢出3只陽性個(gè)體，陽性率為18.7%；14只海獅中檢出5只陽性個(gè)體，陽性率為35.7%；13只白鯨中沒有檢出陽性個(gè)體；28只企鵝中檢出5只陽性個(gè)體，陽性率為17.8%；4 只海雀中檢出2 只陽性個(gè)體，陽性率達(dá)50.0%。106 例研究對(duì)象中曲霉病的總體陽性率為23.5%，其中海雀的陽性率最高，白鯨陽性率最低(表1)。

表1 海洋動(dòng)物GM檢測(cè)閾值與陽性結(jié)果Table 1 Threshold value and positive results of GM test

2.2 治療效果

21 例GM 陽性個(gè)體給予口服伏立康唑片或特比萘芬片單用或聯(lián)合用藥，完成14 ～45 d 的抗曲霉菌治療，其中19例療效顯著并治愈，2例海鳥好轉(zhuǎn)，但是需要持續(xù)治療。經(jīng)觀察，特比萘芬單獨(dú)治療有效3 例(治愈率33.3%)，伏立康唑單獨(dú)治療有效6 例(治愈率50.0%)，特比萘芬聯(lián)合伏立康唑治療有效10例(治愈率83.3%)(表2)。21只陽性個(gè)體的整體治愈率為90.5%

表2 兩種抗真菌藥物在治療曲霉病上的療效觀察Table 2 Effect of two antifungal drugs on aspergillosis

2.3 治療前后GM檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 海洋哺乳動(dòng)物治療前后GM檢測(cè)結(jié)果的比較

在14 只海洋哺乳動(dòng)物曲霉病治療中，治療前的GM 值為2.36 ± 2.12，治療后的GM 值為0.34 ± 0.15，療程15 ～45 d，全部治愈。治療前后結(jié)果對(duì)比存在顯著性差異(t= 3.48,P＜0.05)(表3)。

表3 海洋哺乳動(dòng)物治療前后GM檢測(cè)結(jié)果的比較Table 3 Comparison of GM test results of marine mammals before and after treatment

2.3.2 海洋鳥類治療前后GM檢測(cè)結(jié)果的比較

在7 只海洋鳥類曲霉病治療中，治療前的GM值為3.40±2.00，治療后的GM 值為0.88±0.55，整個(gè)療程14 ～45 d，5 只治愈，2 只好轉(zhuǎn)但需要繼續(xù)治療?？傮w上治療前后結(jié)果對(duì)比存在顯著性差異(t=3.227,P＜0.05)(表4)。

表4 海洋鳥類治療前后GM檢測(cè)結(jié)果的比較Table 4 Comparison of GM test results of marine birds before and after treatment

3 討論

GM 為真菌的一種抗原成分，在感染早期便釋放入動(dòng)物血液中，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其水平變化，具有早期診斷和判斷療效的作用(盧洪洲等，2018)。Platelia Aspergillus是目前用ELISA法檢測(cè)GM 的唯一商品化試劑盒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示該試劑盒具有良好的敏感性及特異性(Marret al.,2004)，然而在臨床運(yùn)用過程中，由于研究群體不同、個(gè)體的真菌負(fù)荷量不同、選取的侵襲性曲霉病診斷標(biāo)準(zhǔn)不同及樣本在收集處理和檢測(cè)過程中一些不可控制因素等的影響，不同研究得出的GM試驗(yàn)的敏感度、特異度等各不相同。目前，國內(nèi)外對(duì)于GM 試驗(yàn)陽性閾值仍難統(tǒng)一，人類醫(yī)學(xué)上，歐洲普遍使用0.7 ～1.0，美國則為0.5 (Maertenset al., 2002)。耿哲等(2011)從2 658 篇文獻(xiàn)中篩選出20 篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)，分析結(jié)果顯示，血清GM 檢測(cè)診斷曲霉病時(shí)以0.7為閾值時(shí)早期診斷價(jià)值較大。這與本文在探索圈養(yǎng)海洋哺乳動(dòng)物的陽性閾值0.7較為一致。雖然對(duì)于閾值的設(shè)定仍然存在爭(zhēng)議，但由此可見GM 抗原檢測(cè)在曲霉菌檢測(cè)中的重要性。建議臨床實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)調(diào)整閾值，以達(dá)到最佳臨床效果。

本研究同樣探討了海洋鳥類的GM 閾值選擇問題，當(dāng)海鳥陽性閾值為1.2時(shí)比較接近真實(shí)感染情況。為減少檢測(cè)的假陽性及假陰性，我國人類醫(yī)學(xué)侵襲性真菌感染的診斷與治療指南將連續(xù)2 次GM 陽性作為微生物感染的標(biāo)準(zhǔn)(中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)，2007)。但由于早期經(jīng)驗(yàn)性治療的介入，血清GM 的濃度可能出現(xiàn)降低，造成連續(xù)血清GM陽性達(dá)不到要求，同時(shí)重復(fù)檢測(cè)對(duì)血液標(biāo)本需求量也大，因此，本研究認(rèn)為結(jié)合動(dòng)物基礎(chǔ)病及臨床動(dòng)物高危因素，即使單次GM 測(cè)定陽性，也應(yīng)高度懷疑曲霉病，并借以指導(dǎo)早期治療。

GM 屬于多聚抗原，其參與構(gòu)成曲霉細(xì)胞壁，當(dāng)曲霉菌進(jìn)入機(jī)體后，其能夠不斷繁殖進(jìn)而釋放GM，使得血液和組織液中GM 抗原含量上升，且與患者臨床癥狀、影像學(xué)異常出現(xiàn)時(shí)間相比，GM試驗(yàn)陽性反應(yīng)要更早(林少剛等，2020)，這為本研究的早期診斷提供了強(qiáng)有力的理論支持。曲霉病的預(yù)后與早期診斷密切相關(guān)，早期診斷及時(shí)治療，預(yù)后好，否則預(yù)后差。最近，美國傳染病學(xué)會(huì)和《臨床傳染病雜志》共同指出，盡管治療技術(shù)正在進(jìn)步，但早期診斷出侵襲性真菌感染仍然是關(guān)鍵(Infectious Diseases Society of America,2016)。

本研究106 例動(dòng)物中篩查出25 例陽性個(gè)體，其中有21 例屬于真陽性，說明GM 檢測(cè)特異度較高，抗真菌治療前后GM 抗原水平分析顯示治療后GM 值明顯低于治療前，說明GM 試驗(yàn)的靈敏度高。本研究的GM 陽性病例，抗真菌治療時(shí)選用特比萘芬、伏立康唑或者視情況兩者聯(lián)合治療，有效率可達(dá)100%，且治療后患病動(dòng)物GM 值明顯下降，這表明檢測(cè)GM 水平有助于篩選抗真菌藥物。從本研究的高治愈率(90.5%) 來看，早期診斷有助于及早用藥治療，治療效果良好。

本研究中有4 例動(dòng)物GM 陽性，但動(dòng)物未見任何病癥，血檢亦正常。其中有1例經(jīng)抗真菌治療后血檢有好轉(zhuǎn)但未完全轉(zhuǎn)陰，隨訪觀察2個(gè)月亦未發(fā)病。另1 例陽性患者GM 檢測(cè)前有阿莫西林克拉維酸鉀治療史，考慮為假陽性結(jié)果。當(dāng)出現(xiàn)影響GM檢測(cè)結(jié)果可靠性的情況時(shí)，需要進(jìn)一步的證據(jù)來判斷是否被曲霉菌感染，此時(shí)可綜合參考臨床情況、血液分析及其他輔助檢查方法。由于曲霉病的發(fā)病率逐步上升且病死率較高，對(duì)感染概率高的病例進(jìn)行早期抗真菌治療，是提高治療有效率及存活率的關(guān)鍵(傅中明等，2011)。

本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用伏立康唑和特比萘芬的有效率比單獨(dú)使用其中任何一種藥物的有效率都要高，單獨(dú)使用伏立康唑治療的有效率高于單獨(dú)使用特比萘芬。這提示當(dāng)遇到曲霉菌嚴(yán)重感染時(shí)，首選伏立康唑或聯(lián)合用藥有助于增加治愈率。本研究進(jìn)行了部分可疑曲霉病病例抗真菌治療，治療效果顯著。究其原因是不依賴耗時(shí)較長的血液培養(yǎng)及痰培養(yǎng)，參考臨床及GM檢測(cè)結(jié)果，在早期即做出診斷并進(jìn)行治療。該結(jié)果同樣提示早期給予抗真菌治療是改善預(yù)后效果非常重要的因素。

綜上所述，將GM 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于海豚、白鯨、海獅、海象、企鵝和海雀等瀕危海洋動(dòng)物，作為一種曲霉病早期診斷手段，其靈敏度較高，特異度高。本研究結(jié)果具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。圈養(yǎng)海洋動(dòng)物有可疑曲霉病臨床表現(xiàn)時(shí)，建議盡早進(jìn)行GM 檢測(cè)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)GM 水平變化可作為一項(xiàng)評(píng)價(jià)療效的重要指標(biāo)。但是本研究中物種病例樣本量仍然不夠充分，將來需要通過大量病例驗(yàn)證和細(xì)致檢測(cè)確定GM閾值。

致謝：感謝珠海長隆海洋王國動(dòng)物醫(yī)院和動(dòng)管部的同事為本文得以順利完成付出的辛勤工作。感謝廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心提供專業(yè)GM抗原檢測(cè)結(jié)果。