圈養(yǎng)大熊貓冷凍精液對(duì)其種群遺傳多樣性的作用

王東輝 劉玉良 沈富軍 蔡志剛 安俊輝 侯蓉*

（1 成都大熊貓繁育研究基地，成都 610081）（2 四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610081）（3 四川省大熊貓科學(xué)研究院，成都 610081）

由于棲息地破壞、全球氣候變化以及人類活動(dòng)的干擾，許多野生動(dòng)物種群正在減少。為保護(hù)野生動(dòng)物遺傳和物種多樣性，人工輔助生殖技術(shù)不斷發(fā)展革新，在圈養(yǎng)野生動(dòng)物繁育與遺傳多樣性的保護(hù)中發(fā)揮重要作用。常規(guī)人工輔助生殖技術(shù)主要包括人工授精、體外受精和胚胎移植。通過人工輔助生殖技術(shù)使繁育個(gè)體成功繁殖，可有效管理和拯救小種群(Ballou, 1984)。此外，開發(fā)“種質(zhì)資源庫”(精子、卵子和胚胎冷凍保存)，可以使高遺傳價(jià)值種質(zhì)資源得以保存并延續(xù)，進(jìn)一步提升種群高質(zhì)量繁殖的潛力，維持物種多樣性。

Veprintsev 和Rott (1979) 首先提出利用人工輔助生殖技術(shù)和建立種質(zhì)資源庫的方式管理圈養(yǎng)野生動(dòng)物種群的概念。通過該方式可以提高圈養(yǎng)種群個(gè)體繁殖效率，同時(shí)便于種群的遺傳管理(Wildtet al.,2010)。目前，已經(jīng)有報(bào)道多個(gè)野生動(dòng)物圈養(yǎng)種群成功使用冷凍精液(凍精) 人工授精繁殖，如兩棲類(Koubaet al., 2013)、云豹(Neofilis nebulosa) (Tipkanthaet al., 2017)、獵豹(Acinonyx jubatus) (Wildtet al., 1997)、虎貓(Leopardus pardalis) (Swansonet al., 1996)、彎角大羚羊(Oryx dammah) (Morrowet al., 2000) 和蒼羚(Gazella dama mhorr) (Roldanet al., 2006)。此外，凍精人工授精也成功用于某些靈長(zhǎng)類動(dòng)物繁殖中，如狨猴(Callithrix jacchus) (Morrellet al., 1998) 和獼猴(Macaca mullatta) (Gabriel Sanchez-Partidaet al.,2000)。但是，仍有部分物種隨著種群遺傳多樣性的減少，種群繁殖無可持續(xù)性而瀕臨滅絕。據(jù)預(yù)測(cè)，野外白犀牛(Ceratotherium simum) 種群將在2023 年之前滅絕(Di Mininet al.,2015)。對(duì)于這些極度瀕危的物種來說，建立種質(zhì)資源庫可確保遺傳資源長(zhǎng)久保存，防止種群遺傳基因丟失，未來可將死亡或非生育個(gè)體遺傳信息重新注入到種群繁殖中，為種群的復(fù)壯提供潛力。使用冷凍保存20 年的精液成功實(shí)現(xiàn)黑足鼬(Mustela nigripes) 的個(gè)體繁殖，實(shí)現(xiàn)了“死亡復(fù)活”并顯著恢復(fù)了種群的基因多樣性(Howardet al.,2016)。

大熊貓(Ailuropoda melanoleuca) 是我國特有的古老珍稀物種，在地球存活了800 萬年之久，有動(dòng)物界“活化石”的美譽(yù)。20 世紀(jì)80 年代大熊貓已瀕臨滅絕，為保護(hù)大熊貓種群實(shí)施了遷地保護(hù)計(jì)劃。大熊貓遷地保護(hù)計(jì)劃不僅要保護(hù)大熊貓免于滅絕，還要繁育健康和高遺傳多樣性的后代。1978 年，北京動(dòng)物園首先采用大熊貓鮮精進(jìn)行人工授精獲得成功，1980 年成都動(dòng)物園首先應(yīng)用超低溫保存的顆粒凍精成功進(jìn)行了人工授精(胡錦矗，1990)。近年來人工繁育大熊貓數(shù)量實(shí)現(xiàn)快速優(yōu)質(zhì)增長(zhǎng)，“十三五”期間繁育成活大熊貓258 只*，使圈養(yǎng)種群達(dá)到自我維持狀態(tài)。當(dāng)前圈養(yǎng)大熊貓種群的繁殖方式主要采取自然交配和鮮精人工授精，少數(shù)采用凍精人工授精。2017 年的一項(xiàng)回顧性研究分析了1996—2016 年總計(jì)304 只圈養(yǎng)大熊貓繁殖數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示自然交配的產(chǎn)仔率為60.7%，凍精人工授精的產(chǎn)仔率為18.5% (Liet al., 2017)。目前凍精人工授精技術(shù)的產(chǎn)仔率較低，但是著眼于大熊貓種群的長(zhǎng)遠(yuǎn)可持續(xù)發(fā)展，冷凍精液遺傳學(xué)價(jià)值將會(huì)越來越大。因此，本文總結(jié)分析了2000—2014 年凍精人工授精對(duì)圈養(yǎng)種群的遺傳多樣性作用以及建立的大熊貓精子庫對(duì)圈養(yǎng)種群未來發(fā)展的潛在影響，綜合分析了圈養(yǎng)大熊貓冷凍精液對(duì)其種群的遺傳管理價(jià)值，為大熊貓種群繁育與保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

根據(jù)國家林業(yè)和草原局制定的大熊貓繁育配對(duì)方案，成都大熊貓繁育研究基地人工授精的大熊貓個(gè)體。7 只參與凍精人工授精的雌性個(gè)體均性成熟，年齡為5 ～18歲(平均年齡=10歲)。用于采集精液的雄性個(gè)體均達(dá)到性成熟。

1.2 精液采集

采用直腸微電流刺激的方式采集繁殖季節(jié)性成熟雄性大熊貓精液，精液采集全程在大熊貓麻醉中進(jìn)行。麻醉前，大熊貓禁食禁水約12 h。首先肌肉注射氯胺酮(4 ～8 mg/kg)麻醉雄性大熊貓，然后在采集精液過程中使用異氟烷進(jìn)行呼吸式麻醉。用電射精采精儀(Boring，美國) 進(jìn)行電刺激采精。電壓2 ～8 V，持續(xù)2 s 后間歇性休息2 s，出現(xiàn)射精立刻停止刺激，將精液收集到采精杯中。休息30 s 后，重復(fù)電刺激采精2 ～3 次后，完成采精過程。

1.3 精液冷凍與解凍

大熊貓精液冷凍按照之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法完成(Santiago-Morenoet al.,2016)。方法簡(jiǎn)述如下：將采集的鮮精用冷藏液(Irvine Scientific，美國)以1∶1 (v/v) 的比例稀釋在15 mL 試管中，將試管置于裝有150 mL 37℃水的燒杯中，在4℃冰箱中放置3 h 后加入含有12%甘油濃度的冷凍液(Irvine Scientific)，使甘油終濃度為3.33%，精子密度為400×106/mL，將精液在4℃放置1 h；最后，將精液吸入0.25 mL凍精細(xì)管(Fujihira，日本)中，置于液氮面上方7.5 cm 處熏蒸1 min，再轉(zhuǎn)移至液氮面上方2.5 cm處熏蒸1 min后投入液氮中長(zhǎng)期保存。

精液解凍方法按照Wang 等(2020) 方法進(jìn)行。從液氮中取出凍精細(xì)管快速放入50℃水浴中解凍10 s，然后將精液吹入15 mL 試管底部，并加入400 μL 的改良Ham’s F10 (Irvine Scientific) 解凍液置于37℃水浴中孵育。

1.4 人工授精

用于人工授精的精液質(zhì)量要求解凍后精子活力大于50%，運(yùn)動(dòng)狀態(tài)大于3.0，37℃下體外存活時(shí)間大于4 h，精子畸形率小于30%。首先用溫水清洗雌性大熊貓外陰及周圍區(qū)域，再用溫生理鹽水沖洗。緩慢將無菌開膣器旋轉(zhuǎn)插入陰道中并抵到宮頸開口處，然后將輸精管緩慢抵入宮頸口。用注射器吸取1.2 mL精液，連接到輸精管接口處，緩慢將精液注入宮頸內(nèi)；間隔6 ～8 h 后進(jìn)行第二次人工授精。

1.5 平均血緣系數(shù)分析

平均血緣系數(shù)(mean kinship,mK)是用來衡量群體內(nèi)各個(gè)體的遺傳重要性的指標(biāo)。mK 值越小表示該個(gè)體在群體中的親屬越少，其攜帶的等位基因在群體中越稀有且容易丟失，因此具有較高的遺傳重要性；反之，mK 值越大則表示該個(gè)體遺傳重要性程度越低(沈富軍等，2002)。本研究中凍精個(gè)體和整個(gè)圈養(yǎng)大熊貓種群的mK值均查自2019年更新的大熊貓譜系“The 2019 International Studbook For Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca)”(Xie, 2019)。mK 的具體計(jì)算方法參考張志和和魏輔文(2006)。計(jì)算公式：

其中Kij為個(gè)體i和j之間的血緣系數(shù)；N為種群中的個(gè)體數(shù)目。

1.6 遺傳多樣性分析

統(tǒng)計(jì)了成都大熊貓繁育研究基地(以下簡(jiǎn)稱基地)2000—2014 年共7 只個(gè)體的凍精人工授精情況(表1)。凍精個(gè)體的遺傳多樣性(建群者基因多樣性的保留程度) (genetic diversity, GD) 以及圈養(yǎng)大熊貓種群GD值均取自于對(duì)應(yīng)繁殖年份。計(jì)算公式：

表1 2000—2014年大熊貓凍精人工授精個(gè)體參數(shù)及平均血緣系數(shù)(mK)Table 1 Individual parameters and mean kinship(mK)values of giant pandas in artificial insemination with frozen semen from 2000 to 2014

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件(IBM Corp.,美國)，凍精個(gè)體與種群GD 值的差異比較分析采用Student’st-test，數(shù) 據(jù) 用mean ± SD 表 示，P＜0.05 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。mK 計(jì)算采用PMx 軟件(Lacyet al., 2012)。凍精個(gè)體mK 分布統(tǒng)計(jì)采用GraphPad Prism 軟 件 (5.0) (GraphPad Software Inc.,美國)。

2 結(jié)果

2.1 凍精人工授精對(duì)同年圈養(yǎng)大熊貓種群遺傳多樣性的作用

將每只凍精人工授精個(gè)體(凍精個(gè)體) 的遺傳多樣性與同年圈養(yǎng)大熊貓種群的遺傳多樣性進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示每一個(gè)凍精個(gè)體遺傳多樣性均高于對(duì)應(yīng)繁殖年份圈養(yǎng)種群(圖1A)，整體比較分析也顯示所有凍精個(gè)體的平均遺傳多樣性顯著高于圈養(yǎng)種群(圖1B)。

圖1 凍精人工授精個(gè)體(凍精個(gè)體)與對(duì)應(yīng)繁殖年份大熊貓種群的遺傳多樣性比較. A：2000—2014 年人工授精中每個(gè)凍精個(gè)體遺傳多樣性與對(duì)應(yīng)繁殖年份種群遺傳多樣性；B：2000—2014年人工授精中所有凍精個(gè)體平均遺傳多樣性與圈養(yǎng)種群的比較. 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示. *P ＜0.05Fig. 1 Genetic diversity of frozen semen individuals compared to the giant panda population in the corresponding breeding year. A:From 2000 to 2014, the genetic diversity of every frozen semen individual in artificial insemination and the giant panda population in the corresponding breeding year. B:Statistical comparison of the average genetic diversity of all frozen semen individuals in artificial insemination to the giant panda population from 2000 to 2014. Quantified data show the mean±SD. *P ＜0.05

2.2 精子庫中保存的已死亡個(gè)體精液對(duì)種群遺傳多樣性的潛在影響

截止2021年7月底，基地大熊貓精子庫中保存21只已死亡個(gè)體的精液。該21只個(gè)體mK值分布范圍廣，個(gè)體間差異較大(圖2A)。與圈養(yǎng)種群mK值(mK = 0.022 8) 比較，7 只個(gè)體mK 值高于圈養(yǎng)種群，占個(gè)體總數(shù)的33.33%；66.67%的個(gè)體(14只)mK 值在圈養(yǎng)種群mK值之下(圖2B)，這14只個(gè)體中35.71%的個(gè)體(5只)mK=0.000 0，7.14%的個(gè)體(1 只)mK 值在0.001 0 ～0.005 0，28.57%的個(gè)體(4 只)mK 值在0.005 0 ～0.010 0，21.43%的個(gè)體(3 只) mK 值在0.010 0 ～0.015 0，7.14%的個(gè)體(1只)mK值在0.015 0 ～0.022 8(圖2C)。

圖2 精子庫中保存死亡個(gè)體平均血緣系數(shù)(mK)值統(tǒng)計(jì). A：凍精個(gè)體mK 值與圈養(yǎng)種群mK 值；B：與圈養(yǎng)種群mK 值對(duì)比，各凍精個(gè)體mK值；C：低于圈養(yǎng)種群mK值的凍精個(gè)體mK值，不同顏色區(qū)域代表不同mK值范圍Fig. 2 The mean kinship(mK)values of preserved dead individuals in the sperm bank. A:mK values of frozen semen individuals and captive population;B:Pie chart of mK values of each frozen semen individual with the mK values of captive population as a comparison;C:Pie chart of mK values of frozen semen individuals below the mK values of captive population,with different color areas representing different mK ranges

2.3 精子庫中保存的20歲以上存活個(gè)體精液對(duì)種群遺傳多樣性的潛在作用

截止2021 年7 月底，基地大熊貓精子庫中保存14 只20 歲以上存活個(gè)體的精液。該14 只個(gè)體mK 值與圈養(yǎng)種群mK 值(mK = 0.022 8)比較，除個(gè)別與圈養(yǎng)種群mK 相差較大外，大部分個(gè)體更為接近圈養(yǎng)種群mK 值(圖3A) 。14 只個(gè)體中有7 只個(gè)體mK 值高于0.002 8 (圖3B)。此外，對(duì)低于0.022 8 的7 只個(gè)體mK 值進(jìn)行分析，其中有14.29%的個(gè)體(1 只) mK 值在0.000 0 ～0.001 0，有14.29%的個(gè)體(1只)mK值在0.005 0 ～0.010 0，有28.57%的個(gè)體(2只)mK值在0.010 0 ～0.020 0，有42.86%的個(gè)體(3 只)mK 值在0.020 0 ～0.022 8(圖3C)。

圖3 精子庫中保存20歲以上存活個(gè)體平均血緣系數(shù)(mK)值統(tǒng)計(jì). A：凍精個(gè)體mK值與圈養(yǎng)種群mK值；B：與圈養(yǎng)種群mK值對(duì)比，各凍精個(gè)體mK值；C：低于圈養(yǎng)種群mK值的凍精個(gè)體mK值，不同顏色區(qū)域代表不同mK值范圍Fig. 3 The mean kinship (mK) values of surviving individuals over 20 years old kept in sperm bank. A: mK values of frozen semen individuals and captive population;B:Pie chart of mK values of each frozen semen individual with the mK values of captive population as a comparison;C:Pie chart of mK values of frozen semen individuals below the mK values of captive population,with different color areas representing different ranges of mK values

2.4 精子庫中保存的20歲以下存活個(gè)體精液對(duì)種群遺傳多樣性的潛在作用

截止2021 年7 月底，基地大熊貓精子庫中還保存有15只20歲以下個(gè)體的精液。該15只個(gè)體的mK值不規(guī)則分布在圈養(yǎng)種群的mK值水平線兩側(cè)，個(gè)體間差異較大(圖4A)。與圈養(yǎng)種群的mK 值(mK = 0.022 8) 進(jìn)行對(duì)比，15 只個(gè)體中有46.67%的個(gè)體(7 只)mK 值高于圈養(yǎng)種群mK 值，53.33%的個(gè)體(8只)mK值在圈養(yǎng)種群mK值之下(圖4B)。此外，對(duì)低于圈養(yǎng)種群mK 值的總計(jì)8 只個(gè)體mK值進(jìn)行分析，其中有12.50%的個(gè)體(1 只) mK =0.000 0，有25.00%的個(gè)體(2只)mK值在0.001 0 ～0.010 0，有37.50%的個(gè)體(3只)mK值在0.010 0 ～0.020 0，有25.00%的個(gè)體(2只)mK 值在0.020 0 ～0.022 8(圖4C)。

圖4 精子庫中保存20歲以下存活個(gè)體平均血緣系數(shù)(mK)值統(tǒng)計(jì). A：凍精個(gè)體mK值與圈養(yǎng)種群mK值；B：與圈養(yǎng)種群mK值對(duì)比，各凍精個(gè)體mK值；C：低于圈養(yǎng)種群mK值的凍精個(gè)體mK值，不同顏色區(qū)域代表不同mK值范圍Fig. 4 The mean kinship(mK)values of surviving individuals under 20 years old kept in the sperm bank. A:mK values of frozen semen individuals and captive population;B:Pie chart of mK values of each frozen semen individual with the mK values of captive population as a comparison;C:Pie chart of mK values of frozen semen individuals below the mK values of captive population,with different color areas representing different ranges of mK values

3 討論

遺傳資源低溫冷凍保存是保護(hù)珍稀物種遺傳多樣性的有力工具(Blackburn, 2018)。近幾十年，精液采集和冷凍保存技術(shù)快速發(fā)展，已經(jīng)成功應(yīng)用于部分瀕危物種的種群繁殖和管理(Hermeset al., 2009; Hildebrandtet al., 2012, 2021; Howardet al., 2016)。種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存和利用可以延長(zhǎng)種群的世代長(zhǎng)度，并允許在較小的種群中保持較高水平的遺傳變異(Comizzoli,2015)，能夠拯救更多的瀕危物種。大熊貓精液冷凍保存歷經(jīng)了40 余年的發(fā)展，提高冷凍精液的應(yīng)用潛力對(duì)進(jìn)一步改善圈養(yǎng)大熊貓種群的遺傳多樣性具有重要意義。本文從大熊貓凍精人工授精和凍精保存兩方面系統(tǒng)分析了圈養(yǎng)大熊貓冷凍精液對(duì)其種群遺傳多樣性的作用，為大熊貓種群遺傳管理提供科學(xué)依據(jù)。

交配機(jī)會(huì)少是導(dǎo)致大熊貓生育力低下的主要因素，大部分圈養(yǎng)雄性大熊貓不能夠自然交配(Zhanget al., 2021)。凍精人工授精不僅解決了自然交配困難個(gè)體的繁殖問題，而且凍精便于運(yùn)輸，解決繁殖地域隔離問題，進(jìn)一步促進(jìn)了種群的遺傳管理。本研究分析了2000—2014 年大熊貓凍精個(gè)體與種群的遺傳多樣性及冷凍精液對(duì)圈養(yǎng)種群遺傳多樣性的作用，發(fā)現(xiàn)大熊貓凍精個(gè)體的遺傳多樣性均高于繁殖年份種群的平均遺傳多樣性，說明在對(duì)應(yīng)繁殖年份中凍精人工授精對(duì)整個(gè)種群遺傳多樣性具有促進(jìn)作用。瀕危野生動(dòng)物種群數(shù)量極少，能夠參與的繁殖個(gè)體更為稀少，增加自然交配困難個(gè)體的繁殖概率可以促進(jìn)種群遺傳多樣性。2020 年史密森尼保護(hù)生物學(xué)研究所(Smithsonian Conservation Biology Institute)報(bào)道使用凍存5 年的精液成功使雌性大熊貓受孕并產(chǎn)仔(Comizzoli,2020)，進(jìn)一步證實(shí)了精液冷凍保存對(duì)大熊貓遺傳多樣性保護(hù)的重要作用。

精子庫是了解和維持物種繁殖以及保護(hù)生物多樣性的寶貴工具。建立精子庫可以永久保存物種的生殖資源，保護(hù)現(xiàn)有的物種遺傳多樣性免受不可預(yù)知的危害，包括對(duì)野生種群的滅絕災(zāi)難(Roelke-Parkeret al.,1996)。目前成都大熊貓繁育研究基地大熊貓精子庫中保存有50 只個(gè)體總計(jì)7 000 余支細(xì)管精液，涵蓋的個(gè)體中有部分是已死亡個(gè)體或老齡個(gè)體。這些個(gè)體不僅精液存量極為有限，而且具有較高的遺傳價(jià)值。通過對(duì)比分析凍精的死亡個(gè)體與圈養(yǎng)種群的mK 值，發(fā)現(xiàn)21 只死亡個(gè)體中有14 只個(gè)體的mK 值低于圈養(yǎng)種群，表明已死亡個(gè)體的遺傳價(jià)值較高，對(duì)于圈養(yǎng)種群遺傳多樣性的提高具有促進(jìn)作用。值得注意的是，其中有5 只死亡個(gè)體的mK 值為零，這意味著該個(gè)體尚未繁殖后代，在當(dāng)前種群中其遺傳信息處于丟失狀態(tài)，增加了種群遺傳多樣性保護(hù)的難度。同樣地，圈養(yǎng)非洲草原象(Loxodonta africana) 種群正面臨遺傳多樣性下降問題，研究者提出解決這一難題的有效且可持續(xù)的方法是從野外象群中引入精液用于圈養(yǎng)種群繁殖(Hermeset al.,2013)。目前圈養(yǎng)大熊貓種群雖然呈現(xiàn)可自我維持狀態(tài)，無需從野外種群引入精液，但mK 值為零的死亡個(gè)體的冷凍精液對(duì)于當(dāng)前圈養(yǎng)種群就是全新的種質(zhì)資源，未來將其用于繁殖生產(chǎn)，能夠增加圈養(yǎng)種群的遺傳多樣性。

基地大熊貓精子庫中還保存了29 只存活個(gè)體的精液，其中20 歲以上14 只。圈養(yǎng)大熊貓平均壽命約25 ～30 歲，20 歲以上已經(jīng)趨于老齡化狀態(tài)，繁殖能力逐年下降，逐漸退出繁殖計(jì)劃。通過mK值的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)有50.00%的老年個(gè)體mK 值低于圈養(yǎng)種群，且有4 只個(gè)體mK 值小于0.020 0，說明老年個(gè)體的冷凍精液不但具有豐富圈養(yǎng)種群遺傳多樣性的潛在價(jià)值，而且部分屬于高遺傳價(jià)值個(gè)體，未來對(duì)圈養(yǎng)種群遺傳多樣性的維持將發(fā)揮更大的作用。20 歲以下的個(gè)體中有53.33%的個(gè)體mK 值低于圈養(yǎng)種群，同樣表明這部分個(gè)體的凍精具有較高的遺傳價(jià)值。值得注意的是，這部分個(gè)體是當(dāng)前繁殖計(jì)劃的主體，主要采取自然交配以及鮮精人工授精的方式。因此，本文分析的凍精個(gè)體mK 值在圈養(yǎng)種群中的分布會(huì)隨著后代出生而發(fā)生改變，但是精液的長(zhǎng)久保存會(huì)增加繁殖的世代間隔，在未來的圈養(yǎng)種群繁殖中同樣具有遺傳價(jià)值。建立精子庫保存物種遺傳多樣性同樣適用于其他瀕危野生物種。據(jù)報(bào)道，世界上大多數(shù)野生貓科動(dòng)物因棲息地喪失、破碎化和偷獵等導(dǎo)致數(shù)量銳減，2/3 的貓科動(dòng)物在國際自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN) 的紅色名錄中被列為受威脅物種(IUCN,2021)。為防止種群滅絕，遷地保護(hù)種群繁育工作尤為關(guān)鍵。然而，由于繁殖成功率低、建群者數(shù)量少和種群規(guī)模小，北美動(dòng)物園的大多數(shù)圈養(yǎng)貓科動(dòng)物種群無法僅靠自然繁殖維持種群長(zhǎng)期可持續(xù)發(fā)展(Swanson, 2006)。提升精液冷凍水平，建立精液資源庫保存死亡個(gè)體和未繁育個(gè)體的精液資源，實(shí)現(xiàn)野外個(gè)體精液與圈養(yǎng)種群的基因交流可以有效提高種群的遺傳多樣性，促進(jìn)圈養(yǎng)種群高質(zhì)量可持續(xù)發(fā)展(Vansandtet al.,2021)。

綜上所述，無論是從用于繁殖生產(chǎn)已兌現(xiàn)的遺傳價(jià)值還是尚未用于繁殖生產(chǎn)潛在的遺傳價(jià)值方面，大熊貓冷凍精液都能夠提升圈養(yǎng)大熊貓種群遺傳多樣性，對(duì)圈養(yǎng)種群的遺傳管理具有積極的促進(jìn)作用。

隨著大熊貓種群繁殖的世代更替，冷凍精液在圈養(yǎng)種群繁殖與管理中的作用日益凸顯。但是，目前冷凍精液直接用于種群繁殖還需解決以下3個(gè)關(guān)鍵難題：(1)低溫冷凍過程會(huì)造成精子損傷，顯著降低精子活力(Spindleret al.,2004,Wanget al.,2020)，因此發(fā)展精液冷凍技術(shù)進(jìn)一步提升大熊貓凍精質(zhì)量仍是未來大熊貓繁殖研究的重點(diǎn)；(2)大熊貓精子庫中的精液質(zhì)量參差不齊，其中約有20%的精液解凍后的活力低于30%，無法用于人工授精，導(dǎo)致其使用潛力過低，需要對(duì)精子庫中凍精進(jìn)行質(zhì)量?jī)?yōu)選，提高現(xiàn)存凍精質(zhì)量達(dá)到人工授精標(biāo)準(zhǔn)，提高利用率；(3)與自然交配相比，大熊貓凍精人工授精產(chǎn)仔率仍然較低，2004—2010 年中國大熊貓保護(hù)研究中心進(jìn)行了20 次凍精人工授精，產(chǎn)仔率為25% (Huanget al.,2012)，因此還需要在人工授精技術(shù)方面進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步提高人工授精產(chǎn)仔率。相信通過繁育技術(shù)的不斷革新，冷凍精液會(huì)在大熊貓繁殖中發(fā)揮更大的作用，進(jìn)一步豐富圈養(yǎng)大熊貓種群遺傳多樣性。