甲型流感病毒T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)及HLA-A2限制性抗原肽篩選*

韓雪， 寸怡娜， 朱蘭芳， 王泯驛， 盧天暢， 姚宇峰， 史荔， 陶玉芬*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118)

流感病毒是單負(fù)鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科[1]，可導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸道疾病甚至死亡。2019年，《柳葉刀》雜志報(bào)道季節(jié)性流感造成的死亡病例約有29萬(wàn)至65萬(wàn)[2]，甲型流感病毒(influenza A viruses，IAV)和乙型流感病毒主要引起季節(jié)性流行，其中病毒株A/California/7/2009(H1N1)已經(jīng)傳播50年[3]。接種疫苗是對(duì)抗流感最有效的方法，但目前獲得許可的流感疫苗很少能夠針對(duì)變異株提供有效的保護(hù)[4]。為克服現(xiàn)有流感疫苗的局限性，開(kāi)發(fā)一種針對(duì)病毒保守組分的通用流感疫苗已成為研究的熱點(diǎn)。有研究利用流感病毒保守的基質(zhì)蛋白胞外區(qū)(matrix protein 2 extracellular region, M2e)和血凝素莖域(hemagglutinin stem，HA stem)的流感疫苗，在小鼠中證明了該疫苗對(duì)多種流感病毒感染具有保護(hù)性[5]。由美國(guó)Altimmune公司研制的T細(xì)胞表位疫苗FP-01.1可通過(guò)肌肉注射、引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且耐受性和安全性良好[6]。作為一種主要的通用疫苗形式，基于流感病毒保守表位的疫苗不僅可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，而且可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)清除感染，細(xì)胞免疫在控制流感中發(fā)揮重要作用[7-9]。在小鼠中，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞因子和趨化因子，在免疫應(yīng)答的早期保護(hù)中起關(guān)鍵的作用[7]；在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，交叉反應(yīng)性T細(xì)胞可以誘導(dǎo)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物流感病毒的早期清除[8-9]。同時(shí)，CTL的應(yīng)答是人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen， HLA )限制性，即特定HLA分子只識(shí)別特定的抗原肽，形成穩(wěn)定的HLA-Ⅰ類(lèi)肽加工復(fù)合體將病毒肽段呈遞于細(xì)胞表面，才能誘導(dǎo)CTL的識(shí)別和殺傷。此外，HLA基因呈現(xiàn)高度多態(tài)性，其中HLA-A*02 ∶01等位基因是全球人群HLA-Ⅰ類(lèi)等位基因中是最常見(jiàn)的一種，頻率為39.08%，中國(guó)人群為14.62%[10]。本研究基于H1N1保守的蛋白聚合酶復(fù)合物1(polymerase basic 1，PB1)、核內(nèi)部蛋白(nucleocapsid protein，NP)及基質(zhì)蛋白1(matrix protein 1，M1)蛋白，通過(guò)免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)(immune epitope database，IEDB)進(jìn)行總評(píng)分計(jì)算、人群覆蓋率分析和聚類(lèi)分析預(yù)測(cè)HLA-Ⅰ類(lèi)限制性流感T細(xì)胞表位，進(jìn)而將篩選出的HLA-A*02 ∶01限制性抗原肽進(jìn)行HLA-A*02 ∶01結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性驗(yàn)證以尋找潛在的抗原肽，為通用流感疫苗的開(kāi)發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1抗原肽及T2細(xì)胞 本研究抗原肽純度為95%，由美國(guó)金斯瑞公司合成，T2細(xì)胞購(gòu)于上海復(fù)祥生物公司。

1.1.2主要儀器與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于中國(guó)康寧公司，抗人HLA-A2抗體購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司，人β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)購(gòu)于以色列PROSPEC公司，雷菲德菌素A(Brefeldin A)購(gòu)于美國(guó)MCE公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BECKMAN公司。

1.2 研究方法

1.2.1HLA-Ⅰ抗原肽預(yù)測(cè) 選擇IVA[A/California/7/2009 (H1N1)]作為原始毒株，在Taxonomy Browser中獲取PB1、NP和M1蛋白的序列。PB1序列號(hào)為YP_009118628.1，NP序列號(hào)為AMV49024.1，M1序列號(hào)為YP_009118623.1。通過(guò)IEDB，對(duì)A/California/7/2009(H1N1)的PB1、NP和M1蛋白的CD8+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇70個(gè)HLA-Ⅰ類(lèi)等位基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中包括HLA-A等位基因18個(gè)，HLA-B等位基因32個(gè)， HLA-C等位基因20個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 本研究選擇的HLA等位基因Tab.1 Selected HLA alleles in this study

1.2.2HLA-Ⅰ抗原肽分析 本研究使用總分作為評(píng)估抗原肽指標(biāo)，其中PB1蛋白以0.99為臨界值，NP蛋白以0.53為臨界值，M1蛋白以0.37為臨界值。利用IEDB分析工具將這些抗原肽進(jìn)行聚類(lèi)分析，將序列一致性的最小閾值定位為70%。通過(guò)人群覆蓋率工具分析每個(gè)抗原肽的人群覆蓋率和HLA等位基因的結(jié)合情況，選擇95%為人群覆蓋率的閾值。

1.2.3HLA-Ⅰ抗原肽結(jié)合的親和力及穩(wěn)定性驗(yàn)證 (1)HLA-Ⅰ抗原肽結(jié)合的親和力驗(yàn)證，T2細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)并加入3 μg人β2M，在37 °C條件下與抗原肽孵育16 h后使用HLA-A2抗體染色，檢測(cè)T2細(xì)胞上HLA-A*02 ∶01分子的表達(dá)，用平均熒光指數(shù)(mean fluorescence index，MFI)的變化來(lái)評(píng)價(jià)抗原肽的親和力；(2) HLA-Ⅰ抗原肽結(jié)合的穩(wěn)定性驗(yàn)證，T2細(xì)胞與60 mg/L抗原肽共孵育16 h，用洗液去除未結(jié)合的抗原肽，加入10 mg/L布雷菲德菌素A孵育1 h，用洗液清洗細(xì)胞，分別于、2、4、6及8 h后，加入HLA-A2抗體，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-A*02 ∶02分子的表達(dá)。利用抗原肽-HLA-A*02 ∶01復(fù)合物解離的半衰期(DC50)來(lái)評(píng)估抗原肽與HLA-A*02 ∶01分子結(jié)合的穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, 美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Unpaired T-Test分析方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-Ⅰ類(lèi)抗原肽預(yù)測(cè)

得到PB1、NP和M1蛋白的HLA限制性抗原肽總數(shù)分別為335 151、155 060及108 333條。選擇總分0.990作為PB1蛋白選擇抗原肽的臨界值(75條)，達(dá)到95%以上的人群覆蓋率，通過(guò)聚類(lèi)分析分為25個(gè)聚類(lèi)。選擇總分0.530作為NP蛋白抗原肽選擇(78條)的臨界值，達(dá)到95%以上的人群覆蓋率，其分為20個(gè)簇。對(duì)于M1蛋白，以總分0.37作為M1蛋白進(jìn)行抗原肽選擇(55條)的臨界值，達(dá)到95%以上的人群覆蓋率，并分為13簇。見(jiàn)表2。

表2 PB1、NP和M1蛋白預(yù)測(cè)抗原肽數(shù)目、簇分析、人群覆蓋率Tab.2 Antigenic peptide number,cluster analysis, and population coverage predicted by using PB1,NP, and M1 proteins

2.2 HLA-A*02 ∶01限制性抗原肽的人群覆蓋率

從預(yù)測(cè)所獲得的抗原肽庫(kù)中，篩選出6條HLA-A*02 ∶01的限制性抗原肽，它們與其他HLA分子具有交叉呈遞性 (表3)。例如，PB1-395，除HLA-A*02 ∶01外，可由 HLA-A*02 ∶06、HLA-B*15 ∶01、HLA-B*15 ∶25、HLA-C *03 ∶02、HLA-C*03 ∶03、HLA-C*03 ∶04、HLA-C*12 ∶02、HLA-C*12 ∶03、HLA-C*14 ∶02及HLA-C*16 ∶01分子呈遞。這6條抗原肽在全球的人口覆蓋率為76.98%。

表3 HLA-A*02 ∶01限制性抗原肽長(zhǎng)度、等位基因、總評(píng)分和IC50Tab.3 Total HLA-A *02 ∶01 restricted peptide length, allele, total score, and IC50

2.3 抗原肽與HLA-A*02 ∶01分子的親和力

通過(guò)T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)評(píng)估了抗原肽對(duì)HLA-A*02 ∶01分子的親和力(圖 1A)。選取HLA-A*29 ∶02呈遞的抗原肽PB1-1，作為陰性對(duì)照，M1-58為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示：PB1-407、NP-458和M1-57對(duì)HLA-A*02 ∶01分子的親和力較低，M1-3具有中等親和力、并顯示為抗原肽濃度依賴(lài)性；PB1-395具有高親和力，在60 μg劑量時(shí)，PB1-395和陽(yáng)參肽M1-58的MFI均達(dá)到飽和狀態(tài)，PB1-39的MFI高于M1-58 (P<0.000 1，圖1B)。 PB1-395隨著抗原肽濃度的增加，MFI沒(méi)有明顯變化；M1-58則隨著劑量的增加，呈下降趨勢(shì)。

注：A為不同抗原肽在濃度梯度下MFI值，B為60 μg劑量下不同抗原肽MFI值，(1)與M1-58比較，P<0.00 01。圖1 T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)中MFI Fig.1 MFI values of T2 cells in binding tests

2.4 HLA-A*02 ∶01分子限制性抗原肽的穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，陰性對(duì)照PB1-1的DC50>2 h，M1-58的DC50 >6 h，PB1-395 DC50>8 h (表4)，PB1-395具有較高的穩(wěn)定性。

表4 候選抗原肽與HLA-A*02 ∶01結(jié)合穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Binding stability of candidate antigen peptides to HLA-A*02 ∶01

3 討論

保守的T細(xì)胞表位可對(duì)不同的流感毒株和亞型提供長(zhǎng)期交叉保護(hù)，使得通用型疫苗的開(kāi)發(fā)成為可能[11]。在本研究中，使用IEBD分析流感A/California/7/2009 (H1N1)株的PB1、NP和M1保守蛋白序列，預(yù)測(cè)出HLA限制性CTL表位75個(gè)PB1表位，78個(gè)NP表位和55個(gè)M1表位。在6個(gè)HLA-A*02 ∶01限制性抗原肽中，PB1-395具有高的親和力和穩(wěn)定性，提示其有可能成為T(mén)細(xì)胞表位疫苗的候選。

T細(xì)胞表位疫苗是流感通用疫苗的研究熱點(diǎn)之一。最近一項(xiàng)在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中表明，CD8+T細(xì)胞表位疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，能使小鼠獲得保護(hù)，抵御流感病毒的攻擊[12]?？乖腗1-58于1991年被發(fā)現(xiàn)，在Bednarek等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)M1-58在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠中具有引起細(xì)胞免疫的能力。此外，在人HLA-A*02 ∶01供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞中，M1-58具有誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞的功能[14]。在本研究中，與M1-58相比，PB1-395對(duì)HLA-A*02 ∶01分子的親和力更高(P<0.0001)。PB1是流感病毒RNA聚合酶核心的關(guān)鍵亞基之一，包含一個(gè)典型的RdRp結(jié)構(gòu)域[15]，此結(jié)構(gòu)域是高度保守的催化核心，結(jié)構(gòu)域中殘基的突變會(huì)導(dǎo)致聚合酶活性的降低[16]。例如，在Waters等[17]的研究中，發(fā)現(xiàn)PB1蛋白序列的395位點(diǎn), 401位點(diǎn)和402位點(diǎn)殘基的突變會(huì)影響聚合酶的活性，在本研究篩選出的PB1-395序列中恰好包含了這3個(gè)位點(diǎn)。PB1-395不僅能被HLA-A*02 ∶01分子呈遞，還可以被HLA-A*02 ∶06、HLA- C*03 ∶03、HLA-C*03 ∶04、HLA-C*03 ∶02、HLA-B*15 ∶25、HLA-C*12 ∶03等其他HLA分子呈遞。作為最常見(jiàn)的HLA等位基因，HLA-A*02 ∶01在全球人群的分布頻率為39.08%，加上HLA-A*02 ∶06、HLA-C*03 ∶03、HLA-C*03 ∶04、HLA-C*03 ∶02、HLA-B*15 ∶25、HLA-C*12 ∶03，累積頻率可達(dá)到60.26%。因此，PB1-395抗原肽制備的T細(xì)胞表位疫苗，有望在全球范圍內(nèi)提供廣泛的保護(hù)。

抗原肽與特定HLA分子的結(jié)合以及相互作用的親和程度取決于抗原肽的氨基酸構(gòu)象和MHC分子的抗原肽結(jié)合凹槽的三維結(jié)構(gòu)[18]。在HLA分子凹槽中的錨定位點(diǎn)是決定抗原肽與HLA分子結(jié)合的重要因素，第2位偏向與亮氨酸或蛋氨酸結(jié)合，第9位偏向與纈氨酸或亮氨酸結(jié)合[19]。在本研究中，PB1-395的第2位和第9位是亮氨酸，可能是與HLA-A*02 ∶01分子結(jié)合的具有較好的穩(wěn)定性和親和力的原因。然而，PB1-407的2號(hào)和9號(hào)位置均為蛋氨酸，但與HLA-A*02 ∶01分子的親和力則較低。而M1-58在2位和9位沒(méi)有這樣的錨定殘基，卻也顯示出很高的穩(wěn)定性和親和力。因此，錨定殘基規(guī)律可能只是影響抗原肽結(jié)合效果的因素之一。與本研究中NP-458具有較低親和力的結(jié)果相反，YK張?jiān)赥2結(jié)合試驗(yàn)中顯示NP-458具有較高的結(jié)合親和力[20]。然而，在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)NP-458和PB1-407誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)均較低，可能與其與HLA-A2的親和力較低有關(guān)[21]。本研究中，M1-3親和力適中，而Derin在干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)M1-3無(wú)顯著反應(yīng)[22]。不同的實(shí)驗(yàn)方法可能是產(chǎn)生不同親和力結(jié)果的可能原因。

綜上，本研究采用免疫信息預(yù)測(cè)獲得了流感病毒限制性抗原肽，抗原肽PB1-395顯示出良好的親和力和穩(wěn)定性，有望成為通用型流感疫苗的候選抗原肽，但還需要進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)抗原肽的免疫原性和有效性。