無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)胎兒染色體非整倍體疾病篩查的臨床意義*

盧虞夫， 趙靖， 雷榆， 韋思佳， 張競(jìng)之， 王正蓉*， 潘衛(wèi)*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

近年來(lái)，隨著二胎政策開(kāi)放、高齡產(chǎn)婦的增加，出生缺陷的發(fā)生率有上升的趨勢(shì)，因此產(chǎn)前篩查和診斷對(duì)于降低出生缺陷的發(fā)生至關(guān)重要[1]。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal test，NIPT) 技術(shù)是從母體血漿中獲取游離的胎兒DNA，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)胎兒患染色體疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。NIPT對(duì)篩查胎兒常見(jiàn)非整倍體異常具有特異性高、假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于性染色體及其他常染色體非整倍體篩查能力獲得逐步拓展[3-4]；相比介入性產(chǎn)前診斷檢測(cè)，NIPT可有效避免對(duì)孕婦帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)與傷害，作為可靠的產(chǎn)前篩查技術(shù)被廣泛運(yùn)用于臨床[5]。NIPT對(duì)21/18/13-三體高風(fēng)險(xiǎn)的符合率較高[6]，但對(duì)于性染色體以及其他非整倍體異常高風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性仍不足，還需進(jìn)一步積累臨床數(shù)據(jù)及應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)；因此，本研究分析貴州省14 872例單胎孕婦基本資料及NIPT檢測(cè)結(jié)果，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷驗(yàn)證NIPT檢出符合率，隨訪(fǎng)其妊娠結(jié)局，評(píng)估NIPT的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1月—2019年12月于貴州省產(chǎn)前診斷中心自主選擇行NIPT的單胎孕婦，排除1年內(nèi)接受過(guò)異體輸血、移植手術(shù)、異體細(xì)胞治療等，共納入單胎孕婦14 872例，孕周12 ～26周，孕齡15～51歲，年齡<25歲2 193例(14.75%)、25～29歲4 642例(31.20%)、30～34歲4 588例(30.85%)、35歲及35歲以上3 899例(23.2%)；孕婦均提供遺傳咨詢(xún)并簽署知情同意書(shū)，告知受檢者NIPT檢測(cè)范圍、適應(yīng)癥、局限性和可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料收集 收集所有孕婦的一般資料，包括姓名、年齡、孕周、民族、孕產(chǎn)史等，錄入收集資料建立個(gè)人電子檔案，用于后續(xù)分析。

1.2.2NIPT檢測(cè) 采集孕婦靜脈血8 mL于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管(石家莊康衛(wèi)士醫(yī)療器械有限公司)中，血漿分離后提取樣品中胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cff DNA)，文庫(kù)制備并質(zhì)控；采用無(wú)創(chuàng)DNA高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析將檢測(cè)所得序列于人類(lèi)基因組參考序列圖譜進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)21/18/13-三體綜合征、性染色體及其他染色體非整倍體，計(jì)算出每條染色體所占比例及測(cè)序讀長(zhǎng)，通過(guò)Z檢驗(yàn)算出各染色體Z值，正常范圍為-3～3之間，若Z值>3提示為三體高風(fēng)險(xiǎn)、若Z值<-3則為單體高風(fēng)險(xiǎn)[7]。

1.2.3羊膜腔穿刺術(shù) NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)且愿意選擇行介入性產(chǎn)前診斷檢測(cè)的孕婦，排空膀胱，取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾；由具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)師根據(jù)超聲定位和監(jiān)測(cè)下，進(jìn)行羊膜腔穿刺抽取羊水；每例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦抽取羊水3管(10 mL/管)注入無(wú)菌試管，羊水2管送檢細(xì)胞遺傳室用于染色體核型分析，羊水1管送檢分子遺傳室用于基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-seq)。

1.2.4染色體核型分析 取1.2.3項(xiàng)下的羊水標(biāo)本由2名實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行兩線(xiàn)細(xì)胞接種，全程無(wú)菌操作，接種羊水10 mL/線(xiàn)；分別置于5%CO2的37 ℃獨(dú)立溫箱開(kāi)放式培養(yǎng)5～6 d 換液、繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)；細(xì)胞狀態(tài)良好、密度適中時(shí)，加秋水仙素處理3 h，細(xì)胞學(xué)處理；羊水染色體核型分析，兩線(xiàn)每線(xiàn)計(jì)數(shù)至少15個(gè)細(xì)胞，分析3個(gè)核型分辨率在320水平條帶以上。

1.2.5CNV-seq檢測(cè) 取1.2.3項(xiàng)下的羊水標(biāo)本，提取DNA構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并做質(zhì)控。將樣本中提取到的DNA使用NextSeq CN500基因測(cè)序儀進(jìn)行全基因組水平的檢測(cè)，采用生物信息學(xué)分析比對(duì)測(cè)序結(jié)果與參考基因堿基序列；將CNV-seq檢測(cè)到的基因組拷貝數(shù)變異片段參照基因組CNVs數(shù)據(jù)庫(kù)Database of Genomic Variants(DGV)、疾病相關(guān)的CNV數(shù)據(jù)庫(kù)(database of genomic variation and phenotype in humans using ensembl resources，DECIPHER)、人類(lèi)在線(xiàn)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)、基因組瀏覽器(university of california santa cruz，UCSC)等評(píng)估是否致病，并根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南(american college of medical genetics and genomics，ACMG)對(duì)檢出的拷貝數(shù)變異(copy numbervariations，CNVs)進(jìn)行分類(lèi)，分為致病、可能致病、可能良性、良性以及意義不明(variants of uncertain significance，VOUS)5大類(lèi)。

1.2.6隨訪(fǎng)資料的收集 所有孕婦生產(chǎn)3～6月后均電話(huà)隨訪(fǎng)妊娠結(jié)局，包括妊娠選擇、妊娠結(jié)局、新生兒健康情況等并記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)孕婦資料及NIPT結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用頻數(shù)、率、構(gòu)成比等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立樣本率或構(gòu)成比的比較；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)的檢出

14 872例單胎孕婦中經(jīng)NIPT檢測(cè)出染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)者267 例，總檢出率為1.79%。經(jīng)率的線(xiàn)性趨勢(shì)卡方χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)檢出率有隨單胎孕婦年齡增加而增加的趨勢(shì)(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各年齡組孕婦染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)的檢出[n(%)]Tab.1 Detection of high-risk of chromosomal aneuploidy among pregnant women of various age groups[n(%)]

2.2 染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)的類(lèi)型

各年齡組孕婦NIPT檢出染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型構(gòu)成檢測(cè)結(jié)果顯示，不同年齡組檢出類(lèi)型構(gòu)成差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各年齡組孕婦NIPT檢出染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型的構(gòu)成[n(%)]Tab.2 The composition of the types of high-risk results indicated by NIPT detection among pregnant women of various age groups[n(%)]

2.3 染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的介入性產(chǎn)前診斷

NIPT結(jié)果提示21-三體高風(fēng)險(xiǎn)有42例，行染色體核型分析確診36例，符合率85.71%(36/42)，羊水染色體核型均為47,XN,+21，其中1例核型46,XN,inv(9)(p12q13)，正常核型5例；提示18-三體高風(fēng)險(xiǎn)13例，染色體核型分析8例符合，符合率61.53%(8 /13)，核型均為47,XN,+18，正常核型5例；提示13-三體高風(fēng)險(xiǎn)2例，染色體核型分析均為正常核型，符合率為0%；提示性染色體異常31例，染色體核型分析確診15例，符合率48.39%(15/31)，其中核型47,XXY有6例，核型47,XYY有3例，核型47,XXX有3例，核型45,X有2例，核型為嵌合體45,X[30]/47,XXX[30]有1例，1例病例核型為46,XN,21pss，其余為正常核型有15例；提示其他常染色體異常17例，染色體核型分析確診異常3例，符合率17.56%(3/17)，核型46,XN,del(10)(q26)有1例，核型46,XN,9qh+,del(18)(p11.32)有1例，核型46,XN,dup(9)(q31q33)有1例，其余14例為正常核型。此外，羊水細(xì)胞CNV-seq結(jié)果顯示，檢出致病或可能致病變異64例，未發(fā)現(xiàn)100 kb以上的微缺失/微重復(fù)變異34例，VOUS 7例。見(jiàn)表3。

表3 染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果Tab.3 Interventional prenatal diagnosis results of high-risk pregnant women with chromosomal aneuploidy

2.4 其他非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的介入性產(chǎn)前診斷

其他非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦有17例，其中檢出CNV<5 Mb樣本11例以及CNV>5 Mb樣本6例；進(jìn)一步介入性診斷，對(duì)比分析羊水染色體核型結(jié)果和羊水細(xì)胞CNV-seq結(jié)果，NIPT檢出CNV結(jié)果的17例病例中羊水細(xì)胞CNV-seq檢測(cè)檢出CNV 8例，其中致病或可致病變異4例、VOUS 4例，未發(fā)現(xiàn)100 kb以上的微缺失/微重復(fù)變異9例(表4)。

表4 染色體其他非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果Tab.4 Interventional prenatal diagnosis results of pregnant women with high risk of other chromosomal aneuploidy

2.5 隨訪(fǎng)結(jié)果

267例NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，105例于本院行產(chǎn)前診斷，于外院行后續(xù)妊娠處理162例，妊娠3～6月對(duì)所有孕婦進(jìn)行電話(huà)隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)結(jié)果顯示，繼續(xù)妊娠54例，終止妊娠78例，失訪(fǎng)30例。見(jiàn)表5。

表5 染色體非整倍高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的妊娠結(jié)局(n)Tab.5 Pregnancy outcomes of pregnant women with high-risk of chromosomal aneuploidy(n)

3 討論

出生缺陷是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，常導(dǎo)致出生胎兒死亡、嬰兒死亡或先天殘疾[8]。我國(guó)出生缺陷患兒每年新增約90萬(wàn)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[9]。世界衛(wèi)生組織將出生缺陷分為三級(jí)，出生缺陷預(yù)防工作的重點(diǎn)在一級(jí)和二級(jí)預(yù)防[10]。二級(jí)預(yù)防是通過(guò)產(chǎn)前干預(yù)、產(chǎn)前篩查(血清學(xué)、超聲檢測(cè))、產(chǎn)前診斷、遺傳學(xué)診斷和宮內(nèi)治療等孕期干預(yù)手段，減少出生缺陷胎兒的出生[11]。NIPT篩查具有較好的染色體非整倍體篩查的靈敏度，特異性以及假陽(yáng)性率較低等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在臨床上大規(guī)模的應(yīng)用[12]。本研究回顧性分析14 872例孕婦的資料以及NIPT結(jié)果，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)267例(檢出率為1.79%)；提示常見(jiàn)非整倍染色體異常如21-三體、18-三體及13-三體高風(fēng)險(xiǎn)共計(jì)154例(154/267)，性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)48例，其他非整倍體65例；分析不同年齡段孕婦染色體非整倍體檢出率，染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)檢出率有隨年齡增加而增加的趨勢(shì)(P<0.001)，年齡35歲以上更易檢出21-三體及其他非整倍高風(fēng)險(xiǎn)，檢出率高原因可能為孕婦年齡在35歲以上卵子出現(xiàn)老化情況，激素水平降低有關(guān)[13]。二胎政策的開(kāi)放，高齡孕婦明顯增多，隨著孕婦年齡越大，染色體畸變的發(fā)生率越高[14-15]；雖然高齡孕婦屬于NIPT檢測(cè)的慎用人群，但提示異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的進(jìn)一步做好產(chǎn)前診斷，能有效減少出生缺陷患兒的出生[16]。

當(dāng)NIPT檢測(cè)結(jié)果提示染色體非整倍體出現(xiàn)異常高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，孕婦應(yīng)做進(jìn)一步有創(chuàng)性的產(chǎn)前診斷進(jìn)行驗(yàn)證。由于NIPT所檢測(cè)的標(biāo)本為全省送檢標(biāo)本，267例NIPT檢出染色體非整倍體異常的孕婦中105例孕婦選擇于本院進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，其中染色體核型分析確診陽(yáng)性61例，PPV為58.09%(61/105)；運(yùn)用CNV-seq檢測(cè)檢出致病或可能致病變異64例，PPV為60.95%(64/105)。其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)PPV為85.71%，是所有檢測(cè)中檢出率最高，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道較為一致[17]。相較羊水染色體核型分析，CNV-seq檢測(cè)額外檢出陽(yáng)性報(bào)告3例，總體PPV提高2.86%。陽(yáng)性檢出率的提高主要是與傳統(tǒng)染色體核型分析比較，CNV-seq分辨率更高，可檢測(cè)出100 kb以上的微缺失/微重復(fù)[18]。但羊水核型中報(bào)告的46,XN,inv(9)(p12q13)、46,XN,21pss未能檢出，原因是CNV-seq技術(shù)存在局限性，不能發(fā)現(xiàn)染色體平衡性結(jié)構(gòu)重排[19]。2種產(chǎn)前診斷技術(shù)存在各有優(yōu)勢(shì)及局限性，產(chǎn)前診斷技術(shù)的聯(lián)合使用以便適應(yīng)臨床需求，同時(shí)能有效提高檢出率，避免漏檢誤檢的情況出現(xiàn)，做好出生缺陷防控[20-21]。

近年來(lái)，隨著無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)分析流程的完善，已研究表明，NIPT可用于篩查其他染色體非整倍體以及致病CNVs運(yùn)用于臨床[22-23]。本研究中65例孕婦NIPT檢出其他非整倍高風(fēng)險(xiǎn)，其中17例孕婦于本院進(jìn)一步行介入性診斷及隨訪(fǎng)，其中3例終止妊娠，其余14例均足月生產(chǎn)。病例1的 NIPT提示10q26.13-q26.3缺失6.4 Mb，羊水染色體核型與CNV-seq均檢出該提示片段異常，CNV-seq結(jié)果顯示檢出明確致病性CNVs：seq[hg19]del(10)(q26.13q26.3)chr10:g.126040001_135440000del，最終孕婦選擇終止妊娠。病例7的NIPT檢出1p13.2-p13.1重復(fù)2.8 Mb，羊水染色體核型及CNV-seq結(jié)果均沒(méi)有檢出異常，孕婦自述因自身原因選擇終止妊娠。病例17的NIPT檢出9q31.2-q33.1重復(fù)7.3 Mb，羊水染色體核型與CNV-seq均檢出該提示片段異常，CNV-seq結(jié)果顯示為可致病性，經(jīng)系統(tǒng)B超檢查后，發(fā)現(xiàn)胎兒有較為嚴(yán)重的法洛四聯(lián)癥，最終選擇終止妊娠。病例8 的NIPT檢測(cè)結(jié)果為22q11.21重復(fù)3 Mb，由于拷貝數(shù)過(guò)小，羊水染色體核型未能檢出，其CNV-seq檢測(cè)出相同位子片段seq[hg19]dup(22)(q11.21) chr22:g.18920001_21460000dup，但致病性未知，經(jīng)后續(xù)系統(tǒng)B超檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯異常，孕婦決定繼續(xù)妊娠，經(jīng)隨訪(fǎng)自述至目前為止，胎兒體健，無(wú)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、語(yǔ)言發(fā)育遲緩等臨床表現(xiàn)。同時(shí)隨訪(fǎng)結(jié)果顯示，267例NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中提示其他染色體非整倍體異常高風(fēng)險(xiǎn)者97例，其中近一半孕婦接受產(chǎn)前診斷后選擇繼續(xù)妊娠，從本研究結(jié)果中也可看出，NIPT可以提示CNVs，但與CNV-seq結(jié)果比對(duì)，一致性并不高，對(duì)于常見(jiàn)的微缺失微重復(fù)綜合征可有效檢出，還有很多致病性拷貝數(shù)變異(pathogenic copy number variation，pCNV)不能通過(guò)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)進(jìn)行有效檢測(cè)，需進(jìn)一步完善研究。不過(guò)CNVs的篩查檢出，可根據(jù)該片段數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出的致病信息及臨床表現(xiàn)等，在后續(xù)B超檢測(cè)其定期隨訪(fǎng)中更加關(guān)注是否有相應(yīng)臨床表型的出現(xiàn)，有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，臨床醫(yī)生進(jìn)行遺傳咨詢(xún)時(shí)有指導(dǎo)作用，防止出生缺陷患兒的出生。隨著技術(shù)的發(fā)展、測(cè)序深度的提高，臨床用于微缺失微重復(fù)綜合征篩查是可行的。

綜上所述，NIPT始終只是一種篩查手段，存在假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。在檢測(cè)前，應(yīng)告知孕婦技術(shù)的局限性，當(dāng)NIPT檢測(cè)提示染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)選擇介入性產(chǎn)前診斷，并結(jié)合產(chǎn)前超聲結(jié)果，對(duì)檢測(cè)結(jié)果做好遺傳咨詢(xún)，對(duì)于選擇繼續(xù)妊娠孕婦做到定期隨訪(fǎng)。與單純血清學(xué)篩查相比，NIPT對(duì)染色體非整倍體疾病的檢出率得到了提高，可有效避免侵入性產(chǎn)前診斷操作對(duì)孕婦帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)多種產(chǎn)前診斷方法聯(lián)合應(yīng)用，提高染色體異常的檢出率，預(yù)防胎兒出生缺陷的發(fā)生。