重組人白細胞介素-11對新生大鼠缺氧缺血性腦病的作用*

左丁， 馮占輝， 肖美， 王筱雅， 汪朝云， 熊英， 張晴， 葉蘭***

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 藥理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經內科， 貴州 貴陽 550025； 3.納雍縣人民醫(yī)院 藥劑科， 貴州 納雍 553300； 4.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 多媒體機能學實驗室， 貴州 貴陽 550025)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是導致新生兒永久性發(fā)病和死亡的主要原因之一，是由于腦組織供血、供氧困難所致，與癲癇、腦癱、死亡、短期或長期的神經功能和認知障礙有關[1]。目前的治療HIE方案包括低溫治療、促紅細胞生成素及褪黑素等[2-3]，由于這些治療方案在使用方面受到限制，包括啟動和監(jiān)測體溫過低設施的供給以及經濟因素等，使得輔助治療HIE的新藥研發(fā)仍然具有重要臨床意義。重組人白細胞介素-11(recombinant human interleukin-11，rhIL-11)是促血小板生成藥物，主要通過促進造血干細胞和巨核祖細胞的增殖、誘導巨核細胞成熟及促進高倍性巨核細胞生成，從而增加血小板的生成[4]。研究表明，白細胞介素-11(interleukin-11，IL-11)可預防心臟、肝臟及腦等組織的缺血-再灌注損傷，提示rhIL-11可能作為中樞神經系統(tǒng)性疾病的潛在保護因子[5-7]。目前已有rhIL-11對缺血再灌注損傷、多發(fā)性硬化癥及預防癌癥化療耐藥等有關研究，但未見rhIL-11應用于HIE疾病損傷的相關報道。因此，為了尋找新的治療HIE的輔助治療方案，本研究通過檢測給予rhIL-11后新生大鼠HIE損傷的變化，探究其對HIE的作用，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 新生7 d齡Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體質量12～18 g，雌雄各半，由學校實驗動物中心提供[SCXK (黔) 2018-0001]，所有與動物有關的程序均經過學校實驗室動物倫理委員會的批準(1900029)。

1.1.2主要試劑和儀器 rhIL-11(美國Peprotech)，異氟烷麻醉劑(深圳瑞沃德)，2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色液(北京索萊寶)；R580S型小動物麻醉機(深圳瑞沃德)，AG70厭氧缺氧箱(美國Gene-Science )，GZX-9070 MBE型電熱鼓風干燥箱(上海博迅)。

1.2 研究方法

1.2.1造模和分組 48只新生大鼠隨機均分為假手術(Sham)組、HIE模型組(HIE)、HIE+0.9 μg/kg rhIL-11組、HIE+3.6 μg/kg rhIL-11組。除Sham組外，其余各組新生大鼠使用小動物麻醉機麻醉后固定，于頸部正中做5 mm縱切口，縫合線雙重結扎新生大鼠右頸總動脈并將其從中間剪斷，縫合切口1 h，37 ℃恒溫水浴，8%氧氣和92%氮氣低氧處理2 h；缺氧結束后(檢測腦梗死體積檢測是否造模成功)[8-9]，將各組新生大鼠送回母鼠身邊。Sham組新生大鼠只暴露右頸總動脈，不結扎和缺氧，其余步驟同其余各組，其余各組新生大鼠造模后1 h用4%～5%異氟烷先深度麻醉后切換成1%～2%異氟烷維持麻醉狀態(tài)、固定于立體定位儀，以前囟為原點，水平側移動1.5 mm，向后側2 mm和顱骨表面下2.7 mm進針，使用微量進樣器以1μL/ min的速度將藥物(rhIL-11劑量為0.9 μg/kg和3.6 μg/kg，以0.9%的生理鹽水作為溶劑)注入大腦右半球的側腦室進樣器停留5 min。Sham組和HIE組新生大鼠側腦室注射等體積生理鹽水。建立HIE模型48 h后，進行后續(xù)研究。

1.2.2短期行為學測試 4組新生大鼠HIE造模成功后48 h進行短期行為學測試，內容包括：(1)翻正反射，將新生大鼠仰面置于平臺，手扶持保持仰臥姿勢2 s后松手同時開始計時，記錄新生大鼠翻正到達俯臥位，4只腳站立地面所需要的時間[10]；(2)負趨地性試驗，將新生大鼠頭部朝下置于45 °粗糙斜面，松手后開始計時，記錄新生大鼠旋轉180 °后頭部面向斜面頂部所花費的時間[11]；(3)神經功能缺陷評分，根據規(guī)定新生大鼠行動定義行動和正常動物無異為0分、左側前肢伸展不完全為1分、爬行過程中轉圈為2分、爬行過程中傾倒為3分及不能獨自行走或意識不清為4分[12]。

1.2.3腦梗死體積測定 完成1.2.2項下測試后，4組新生大鼠各取6只測定腦梗死體積。采用水合氯醛麻醉處死4組新生大鼠，快速取腦組織(包含嗅球)，置于腦切片模具，切成連續(xù)2 mm厚的冠狀切片，浸于2%TTC溶液，染色5 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛固定24 h，拍照，使用Image J軟件分析腦梗死體積[8, 13]。

1.2.4腦組織含水量測定[14]完成1.2.2項下測試后，4組新生大鼠各取6只測定腦組織含水量。采用水合氯醛麻醉處死4組新生大鼠，快速取腦組織(去除嗅球和小腦)，置于錫箔紙，擦除多余血漬后稱質量(減去錫箔紙重量為腦組織濕重)；腦組織用錫箔紙包好放入100 ℃烘箱，烘干24 h，稱質量至恒重(減去錫箔紙重量即為腦組織干重)，計算腦組織含水量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 短期行為學測試

建立HIE模型48 h后，與Sham組比較，HIE組新生大鼠的翻正反射、負趨地性試驗時間明顯延長，神經功能缺損評分明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與HIE組比較，HIE+3.6 μg/kg rhIL-11組新生大鼠翻正反射和負趨地性試驗時間減少，神經功能評分降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組新生大鼠翻正反射、負趨地性試驗及神經功能缺陷評分Tab.1 Righting reflex, negative geotactic test, and neurological function deficit scores of neonatal rats in each

2.2 腦梗死體積

TTC染色結果顯示，與Sham組比較，HIE組新生大鼠腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與HIE組比較，HIE+0.9 μg/kg rhIL-11組和HIE+3.6 μg/kg rhIL-11組新生大鼠腦梗死體積明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：(1) 與Sham組相比，P<0.01；(2) 與HIE組相比，P<0.01。圖1 各組新生大鼠的腦梗死體積Fig.1 Cerebral infarct volumes of neonatal rats in each group

2.3 腦組織含水量

腦含水量測定結果顯示，與Sham組比較，HIE組新生大鼠腦組織含水量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與HIE組比較，HIE+3.6 μg/kg rhIL-11組新生大鼠腦組織含水量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組新生大鼠腦組織含水量Tab.2 Brain tissue water contents of neonatal rats in each

3 討論

缺氧缺血引起的腦損傷是導致新生兒死亡和終身殘疾的主要原因。新生兒HIE腦損傷的主要特征是腦組織梗死、水腫和神經功能障礙[15]。目前亞低溫療法是臨床上公認的較為有效的治療方法，但在缺氧缺血后6 h的最佳治療窗內很難實施[16]。由于治療時間窗狹窄和經濟因素等限制，新生兒HIE病理機制和新藥研發(fā)仍然是當下的研究熱點。有學者研究顯示白細胞介素-11(interleukin-11，IL-11)可以減少大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)所導致的梗死體積[7]；在中樞神經系統(tǒng)中，IL-11可限制脫髓鞘、促進髓鞘再生對多發(fā)性硬化癥等脫髓鞘炎癥疾病有保護作用[17]；有研究顯示，當腦室給予rhIL-11時，劑量13.5～250 ng時能改變大鼠體溫發(fā)熱變化[18-19]。

短期行為學結果顯示，rhIL-11可減少新生大鼠的翻正反射、負趨地性試驗時間，降低神經功能缺陷評分。翻正反射反映皮質下成熟，評估運動協調性[20]；負趨地性試驗評估前庭神經和姿勢平衡系統(tǒng)的異常情況，這需要有組織的運動才能成功完成[21]；神經功能缺陷評分評價各組大鼠的神經缺陷嚴重度[22]，這些短期神經行為學結果表明rhIL-11可以改善新生大鼠HIE誘導的神經功能損傷。TTC染色是檢測腦梗死體積的重要指標，當新生大鼠大腦受到缺氧缺血的刺激后會形成明顯的梗死區(qū)域[23]。正常腦組織中含有大量脫氫酶，TTC染色呈紅色，而梗死區(qū)域中因脫氫酶大量減少不能被染色而呈蒼白色[8]。本研究TTC染色結果表明rhIL-11可改善新生大鼠缺氧缺血后的腦損傷，減少腦梗死體積；腦組織含水量的結果顯示rhIL-11可以減輕HIE新生大鼠腦水腫嚴重程度，減少腦含水量。由于腦組織本身沒有葡萄糖和氧氣的儲備能力，在腦缺血后容易產生酸中毒 ,引起腦組織水腫和細胞壞死。因此，有效減少腦水腫的發(fā)生是目前臨床治療缺血性疾病的重要手段[24]。本次腦組織含水量的結果提示，rhIL-11可通過減輕新生大鼠腦組織水腫程度，對HIE疾病起到治療作用。

IL-11信號通路的主要參與者包括糖蛋白130、IL-11受體α(IL-11 receptor alpha，IL-11Rα)，酪氨酸激酶激酶(janus kinase，JAK)/ 信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription ，STAT)、細胞外調節(jié)蛋白激酶/ Ras蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/磷脂酰肌醇三激酶等[11,25]。研究發(fā)現IL-11激活抗凋亡的STAT3信號，上調抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因和Survivin的表達，使順鉑治療作用后的肺腺癌細胞凋亡率下降，增強癌細胞的耐藥性[26-28]。這些學者的研究表明rhIL-11可能是通過介導腦內JAK/STAT3抗凋亡信號通路，減少神經細胞的凋亡，進而產生神經保護作用。其作用機制的探索將是后續(xù)課題需要進一步探究的。