上調(diào)C99片段對(duì)N2a/APP695細(xì)胞中MAM活性及線粒體自噬的影響*

付燕林， 張文萍， 龍培艷， 鄭菊， 高霄， 齊曉嵐， 肖雁*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以大腦中Tau蛋白磷酸化增多和β-淀粉樣蛋白(amyloid protein, Aβ)沉積為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)首先經(jīng)過β-分泌酶剪切生成一個(gè)C端(C99)片段和一個(gè)N端片段(sAPP)，C99再被位于線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 (mitochondrial associated ER membrane, MAM)處的γ-分泌酶誘導(dǎo)到MAM處剪切為Aβ和APP胞內(nèi)功能域(APP intracellular domain, AICD)片段，Aβ不斷積累引起AD的發(fā)生[2-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病機(jī)制可能不是Aβ累積[4-5]，而是C99大量聚集在MAM處后導(dǎo)致MAM的活性上調(diào)，引起線粒體功能障礙[6-7]，但其相關(guān)機(jī)制尚不明確。MAM是由2個(gè)線粒體融合蛋白-2 (mitofusin2, MFN2)相連、線粒體融合蛋白-1(mitofusin1，MFN1)與線粒體分裂蛋白-1(fission1, FIS1)相連，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)束縛在線粒體上形成一個(gè)富含脂質(zhì)的區(qū)域[8-9]，極易受到外在因素的干擾，影響其活性和調(diào)節(jié)功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)MAM的特性可以通過膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1(acetyl-CoAC-acetyl transferase, ACAT1)表達(dá)和線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的偶聯(lián)來表示其活性情況[11-12]。MFN2/1和FIS1蛋白分別調(diào)節(jié)線粒體的融合和分裂，MAM的活性上調(diào)可能會(huì)影響該處的MFN1/2和FIS1蛋白的表達(dá)，造成線粒體分裂融合失衡，引起線粒體自噬增強(qiáng)[13-14]。線粒體自噬的經(jīng)典信號(hào)通路是張力蛋白同源物誘導(dǎo)的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素連接酶(E3 ubiquitinpotein ligase parkin，Parkin)，一般情況下，線粒體外膜上的PINK1被誘導(dǎo)到線粒體內(nèi)膜，當(dāng)線粒體損傷后，PINK1會(huì)聚集在外膜上自身磷酸化而激活，激活下游蛋白Parkin、并與微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)連接, 促進(jìn)自噬體包裹線粒體，線粒體自噬發(fā)生，當(dāng)自噬不斷增強(qiáng)后可能導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[15-16]。因此，本研究以穩(wěn)定表達(dá)APP695小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞株(mouse neuroblastoma cells, N2a)APP695細(xì)胞為AD的細(xì)胞模型，探究AD發(fā)病機(jī)制中C99上調(diào)對(duì)線粒體分裂融合及線粒體自噬的影響，為AD發(fā)病中線粒體功能障礙的后續(xù)研究提供相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞 小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a/APP695由貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室譚俊教授饋贈(zèng)。

1.1.2主要試劑和儀器 FIS1抗體購自Gene Tex公司(美國)，MFN2、MFN1、PINK1、Parkin抗體和Cholesterol Assay Kit(Cell-Based)購自Abcam公司(美國)，LC3、HRP標(biāo)記的兔二抗和鼠二抗購自CST公司(美國)，線粒體探針購自碧云天生物技術(shù)有限公司(中國，上海)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針購自凱基公司(中國，江蘇)，γ-分泌酶抑制劑(DAPT)購自Sigma公司(美國)；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo fisher公司(美國)，多功能酶標(biāo)儀購自 BIOTEK 公司(美國)，激光共聚焦顯微鏡購自奧林巴斯公司(日本)，高速離心機(jī)購自Eppendorf 公司(德國)，GeneGnome XRQ NPC 化學(xué)發(fā)光成像儀購自SYNGENE 公司(英國)，BG-power600 型穩(wěn)流電源購自百晶生物(中國，北京)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將高糖DMEM、opti-MEM、血清及雙抗按照45 ∶44 ∶10 ∶1的比例配成完全培養(yǎng)基；N2a/APP695細(xì)胞從液氮中取出后迅速放置于37 ℃恒溫水浴箱中使其快速溶解，然后轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，再加入PBS 3 mL，1 000 r/min 離心4 min，去掉上清，加入 4 mL 完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞團(tuán)吹散混勻，裝于T25培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞處于生長對(duì)數(shù)期時(shí)以1×106個(gè)/孔種植于6孔板中，細(xì)胞長到80%后，去掉完全培養(yǎng)基，加入純DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為γ-分泌酶抑制劑(DAPT)處理組和正常對(duì)照組(Control)，DAPT處理組去除純DMEM培養(yǎng)基后加入含有DAPT(10 μmol/L)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h，正常對(duì)照組去除純DMEM培養(yǎng)基后加入普通的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h。

1.2.2蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)蛋白表達(dá) DAPT處理組和正常對(duì)照組細(xì)胞分別用1×PBS洗3次，每孔加入1/100 PMSF的RIPA裂解液100 μL，冰上裂解30 min，14 000 r/min離心20 min后收集上清液，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。通過12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)30 mA恒流電泳至蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物分離到合適間距(約1.5～2 h)后結(jié)束電泳；將凝膠中的蛋白質(zhì)通過濕法電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上(200 mA，2 h)，用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗 Y188(1 ∶1 000)、ACAT1 (1 ∶1 000)、MFN1(1 ∶1 000)、MFN2(1 ∶1 000)、FIS1(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)、PINK1(1 ∶200)、Parkin(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶4 000)、BCL-2(1 ∶1 000)及P62(1 ∶1 000)，一抗孵育放置4 ℃冰箱中搖床慢搖過夜。次日回收一抗后用TBST漂洗3次，每次10 min。加入對(duì)應(yīng)的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次10 min。使用ECL發(fā)光試劑盒和GeneGnone XRQ曝光儀進(jìn)行曝光，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.3激光共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的共定位 N2a/APP695細(xì)胞按照5×105個(gè)/孔濃度種植于共聚焦培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長到50%后分組，并按照1.2.1項(xiàng)下的方法對(duì)細(xì)胞分別處理。將ER-Red(1 ∶2 000)和Mito-Tracker Green(1 ∶20 000)分別稀釋于無酚紅培養(yǎng)基中配置成染色工作液，放于37 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫育15 min，去除原培養(yǎng)液，用PBS洗1次，加入ER-Red染色工作液1 mL/孔，37℃孵育30 min。去除ER-Red染色工作液，用無酚紅DMEM洗滌細(xì)胞1～2次，加入Mito-Tracker Green染色工作液1 mL/孔，37 ℃孵育1 h。去除Mito-Tracker Green染色工作液，用無酚紅DMEM洗1次，加入完全培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 N2a/APP695細(xì)胞以5×105個(gè)/孔種植在激光共聚焦培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長到50%后分組，并按1.2.1項(xiàng)下的方法對(duì)細(xì)胞分別處理。取JC-1(200×) 染色試劑37.5 μL加入到8 mL超純水中震蕩溶解，取JC-1染色緩沖液(5×)1.5 mL混勻即為JC-1染色工作液，去除原培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔先加入完全培養(yǎng)基0.5 mL，再加入JC-1染色工作液1 mL，放置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，去除上清，用JC-1緩沖液洗滌1次，加入1 mL完全培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DAPT處理N2a/APP695細(xì)胞后C99表達(dá)情況

結(jié)果顯示，與Control組相比，DATP組N2a/APP695細(xì)胞中C99蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為C99條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖，(1)與Control組比較， P<0.01。圖1 兩組N2a/APP695細(xì)胞中C99蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression levels of C99 in N2a/APP695 cells in each group

2.2 上調(diào)N2a/APP695細(xì)胞中C99水平后的MAM活性

DAPT處理N2a/APP695細(xì)胞20 h后使用線粒體熒光探針(綠光)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針(紅光)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理,結(jié)果顯示，DAPT組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體共定位(黃光)明顯多于Control組；DAPT組中ACAT1的表達(dá)高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位圖，綠色為線粒體，紅色為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，黃色為線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位；B為細(xì)胞中ACAT1蛋白表達(dá)情況，(1)與Control組相比，P<0.05。圖2 上調(diào)N2a/APP695細(xì)胞中C99水平后的MAM活性(激光共聚焦，×100)Fig.2 MAM activity following C99 upregulation in N2a/APP695 cells(laser confocal microscope，×100)

2.3 線粒體分裂融合蛋白的表達(dá)與線粒體膜電位

采用Western blot與JC-1染色分別檢測(cè)線粒體融合與分裂蛋白MFN2、MFN1及FIS1表達(dá)與線粒體膜電位，結(jié)果顯示，與Control組相比，DAPT組細(xì)胞中MFN2、MFN1、FIS1表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)；線粒體膜電位結(jié)果顯示，Control組中細(xì)胞產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較高，DAPT組中細(xì)胞中發(fā)出紅光熒光較少，線粒體膜電位降低，DAPT組中紅光與綠光的比值明顯低于Control組(P<0.01，圖4)。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為MFN1、MFN2、FIS1條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖；與Control組比較， (1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 各組N2a/APP695細(xì)胞中MFN1、MFN2及FIS1蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of MFN1, MFN2, and FIS1 proteins in N2a/APP695 cells in each group

注：線粒體膜電位熒光結(jié)果(10×)；(1)與Control組比較， P<0.01。圖4 兩組N2a/APP695細(xì)胞中線粒體膜電位情況Fig.4 Mitochondrial membrane potential in N2a/APP695 cells of two groups

2.4 線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，與Control組相比，DAPT組N2a/APP695細(xì)胞中PINK1蛋白和Parkin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比例上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為PINK1、Parkin、LC3Ⅰ及LC3Ⅱ條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖；與Control組比較，(1)P<0.01, (2)P<0.05。圖5 兩組N2a/APP695細(xì)胞中PINK1、Parkin及 LC3蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression levels of PINK1, Parkin, and LC3 in N2a/APP695 cells of two groups

2.5 細(xì)胞凋亡情況

Western blot檢測(cè)細(xì)胞抗凋亡蛋白P62、BCL-2表達(dá)結(jié)果顯示，與Control組比較，DAPT組N2a/APP695細(xì)胞中P62、BCL-2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見圖6。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為P62、BCL-2條帶灰度值統(tǒng)計(jì)圖；與Control組比較，(1) P<0.01，(2) P<0.05。圖6 兩組N2a/APP695細(xì)胞中BCL-2、P62蛋白的表達(dá)情況Fig.6 Protein expression levels of BCL-2 and P62 in N2a/APP695 cells of two groups

3 討論

MAM 是線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊密相連的區(qū)域，其參與了細(xì)胞多種代謝功能和疾病的發(fā)生，例如糖尿病、精神分裂癥、肝細(xì)胞癌[17-19]。在AD的早期發(fā)病機(jī)理中，MAM-C99的相互作用被認(rèn)為可能是線粒體功能障礙的一個(gè)非常重要的因素[20-21]，但是其相關(guān)機(jī)制并不十分的清楚。

MAM具有脂筏樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域駐留大量的蛋白使線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，此外，膽固醇代謝的調(diào)節(jié)是其結(jié)構(gòu)形成和功能執(zhí)行的重要決定因素[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)通過檢測(cè)ACAT1表達(dá)變化和線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的偶聯(lián)情況可判定MAM 的活性變化[12]。在本研究中，利用DAPT抑制γ-分泌酶的活性后C99的表達(dá)上調(diào)，ACAT1的表達(dá)上調(diào)、線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的偶聯(lián)增高，這表明C99上調(diào)增加了MAM的活性。MFN2、MFN1和FIS1不僅是形成MAM結(jié)構(gòu)區(qū)域的組成蛋白，還是線粒體分裂融合的調(diào)控蛋白[24-25]，線粒體的融合是有選擇性的，線粒體分裂后的去極化子線粒體不參與到后期的融合中，最終將會(huì)通過自噬消除[26-28]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)C99聚集后(細(xì)胞中水平增加)MAM活性上調(diào)，MFN2、MFN1及FIS1蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，說明線粒體可能通過快速融合與分裂消除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體。采用JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，DAPT組中細(xì)胞線粒體膜電位降低，線粒體膜電位去極化，表明C99聚集后(細(xì)胞中水平增加)后線粒體在快速分裂過程中產(chǎn)生了去極化的子線粒體，它們可能無法參與線粒體的再次融合，最終通過自噬消除，因此線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin及LC3表達(dá)上調(diào)，線粒體自噬增強(qiáng)。有研究報(bào)道，膜電位的下降還與細(xì)胞的凋亡相關(guān)[29-30]。本研究對(duì)抗凋亡蛋白BCL-2、P62進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示BCL-2、P62表達(dá)下降，進(jìn)一步提示細(xì)胞出現(xiàn)凋亡情況。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在AD細(xì)胞模型中C99表達(dá)增加會(huì)上調(diào)MAM活性，影響位于MAM的MFN2、MFN1和FIS1蛋白表達(dá)情況，破壞線粒體分裂融合平衡，導(dǎo)致線粒體自噬增強(qiáng)與細(xì)胞凋亡，這可能是AD中線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷分子機(jī)制之一。